3.1.1. Đặc điểm giải phẫu
3.1.1.1. Đặc điểm vi phẫu lá Đơn châu chấu
Phần gân lá: Gân lá lồi nhiều ở cả hai mặt phía trên và dưới. Biểu bì trên (7) và biểu bì dưới (1) cấu tạo là một lớp tế bào tròn, tương đối nhỏ, xếp đều đặn, mang lông che chở (8). Sát lớp biểu bì trên và dưới là lớp mô dày (2) gồm 3-4 lớp tế bào tròn, thành dày. Mô mềm (3) gồm những tế bào hình trứng, thành mỏng, kích thước lớn, không đều nhau, xếp lộn xộn. Nằm rải rác trong mô mềm có các tinh thể calci oxalat hình cầu gai (9). Bó libe-gỗ hình cung nằm giữa gân lá, libe (4) xếp thành vòng bao quanh gỗ, gỗ (5) cấu tạo bởi những mạch gỗ lớn xếp tập trung thành bó. Bao quanh bó libe gỗ có các ống tiết chất nhày (6).
Phần phiến lá: Biểu bì trên (13) và biểu bì dưới (10) gồm một hàng tế bào hình chữa nhật xếp đều đặn. Mô giậu (12) cấu tạo bởi một lớp tế bào hình chữ nhật xếp thẳng đứng vuông góc với bề mặt lá. Mô khuyết (11) gồm những tế bào thành mỏng, xếp lộn xộn.
Hình 3.1. Vi phẫu lá Đơn châu chấu Ghi chú: • Gân lá: 1- Biểu bì dưới 2- Mô dày 3- Mô mềm 4- Libe 5- Gỗ 6- Ống tiết chất nhày 7- Biểu bì trên • Phiến lá: 10- Biểu bì dưới 11- Mô khuyết 12- Mô giậu 13- Biểu bì trên 8- Lông che chở
9- Tinh thể calci oxalat
3.1.1.2. Đặc điểm vi phẫu thân Đơn châu chấu
Mặt cắt thân hình tròn, từ ngoài vào trong có: biểu bì (1) gồm một hàng tế bào đều đặn, mang gai (11). Xếp sát biểu bì là mô dày gồm 5- 6 lớp tế bào hình tròn, kích thước không đều, thành dày (2). Mô mềm vỏ (3) cấu tạo bởi
1 4 5 3 2 6 11 12 13 10 8 7 9
vài lớp tế bào hình trứng, kích thước không đều nhau, thành mỏng. Nằm rải rác trong mô mềm vỏ có các tinh thể calci oxalat hình cầu gai (10) và các ống tiết chất nhày (5). Sát libe là các đám tế bào thành dày hóa gỗ (4). Libe cấu tạo từ các tế bào nhỏ, tập trung thành từng bó (6). Tầng phát sinh libe- gỗ (7). Bó gỗ gồm những mạch gỗ lớn (8), xếp thành hàng, tập trung thành bó. Phía trong cùng là mô mềm ruột (9).
Hình 3.2. Vi phẫu thân Đơn châu chấu
(a) (b)
Hình 3.3. Tinh thể calci oxalat trong mô mềm vỏ thân khi quan sát ở vật kính 40 (a), và vi phẫu gai Đơn châu chấu (b).
1 3 2 9 4 6 8 5 7 10 11 Chú thích: 1- Biểu bì 2- Mô dày 3- Mô mềm vỏ 4- Đám tế bào thành dày hóa gỗ 5- Ống tiết chất nhầy 6- Libe 7- Tầng phát sinh libe-gỗ 8- Mạch gỗ 9- Mô mềm ruột
10- Tinh thể calci oxalat hình cầu gai
3.1.1.3. Đặc điểm vi phẫu rễ Đơn châu chấu
Mặt cắt ngang hình tròn. Từ ngoài vào trong có: lớp bần (1) gồm 4 - 6 hàng tế bào hình chữ nhật, xếp đều đặn thành vòng đồng tâm và dãy xuyên tâm. Mô mềm vỏ (2) cấu tạo từ những tế bào thành mỏng, phần ngoài thường bị ép bẹt. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai nằm rải rác trong mô mềm vỏ và libe, có thể đứng riêng lẻ hoặc tập trung thành đám (3). Các tế bào libe nhỏ, xếp xít nhau thành dải (4). Tầng phát sinh libe-gỗ (5). Mô gỗ gồm các mạch gỗ kích thước không đều nhau, các bó gỗ xuất phát từ tâm (6).
Hình 3.4. Vi phẫu rễ cây Đơn châu chấu
3.1.2. Đặc điểm bột dược liệu
3.1.2.1. Đặc điểm bột lá Đơn châu chấu
Bột dược liệu màu xanh xám, mùi hắc, vị chát.
6 4 2 1 5 3 Ghi chú: 1- Bần 2- Mô mềm vỏ 3- Đám tinh thể calci oxalat 4- Libe 5- Tầng phát sinh libe- gỗ 6- Mạch gỗ
Hình 3.5. Lá Đơn châu chấu đã phơi sấy khô
Quan sát dưới kính hiển vi thấy: Lông che chở đơn bào và đa bào (4). Mảnh biểu bì mang lỗ khí (3). Các tinh thể calci oxalat hình cầu gai tụ tập thành đám hoặc đứng riêng rẽ (9). Mảnh mô mềm (1) gồm những tế bào hình đa giác, thành mỏng. Mảnh phiến lá mang mạch dẫn (6), mang tinh thể calci oxalat hình cầu gai (5). Mảnh mạch xoắn (7). Sợi có thể đứng riêng rẽ hoặc thành bó sợi (2).
Ảnh chụp các đặc điểm bột lá Đơn châu chấu dưới kính hiển vi được trình bày ở hình 3.6.
Hình 3.6. Một số đặc điểm bột lá Đơn châu chấu Chú thích: 1. Mảnh mô mềm; 2. Bó sợi; 3. Mảnh biểu bì mang lỗ khí 4. Lông che chở
5. Mảnh phiến lá mang tinh thể calci oxalat hình cầu gai 6. Mảnh phiến lá mang mạch dẫn
3.1.2.2. Đặc điểm bột vỏ thân Đơn châu chấu
Bột vỏ thân Đơn châu chấu có màu trắng đục, không mùi, không vị
Hình 3.7. Lát cắt thân Đơn châu chấu
Quan sát dưới kính hiển vi thấy: Mảnh bần (4). Mảnh mô mềm (1), mảnh mô mềm mang tinh thể calci oxalat (2). Sợi thành dày, đứng riêng rẽ hoặc tập trung thành bó (3). Nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai đứng riêng rẽ hoặc tập hợp lại thành đám (5).
Ảnh chụp các đặc điểm bột vỏ thân Đơn châu chấu dưới kính hiển vi được trình bày ở hình 3.8.
Hình 3.8. Một số đặc điểm bột vỏ thân Đơn châu chấu Chú thích:
1. Mảnh mô mềm
2. Mảnh mô mềm mang tinh thể calci oxalat 3. Bó sợi
4. Mảnh bần
5. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai
3.1.2.3. Đặc điểm bột rễ Đơn châu chấu
Bột màu nâu xám, mùi hắc, vị nhạt chát.
Quan sát dưới kính hiển vi thấy: mảnh bần (6), nhiều hạt tinh bột nằm rải rác (8) hoặc tập trung thành đám (9), hạt tinh bột tròn, có rốn hạt rõ. Rải rác có các mảnh mô mềm (1) và các mảnh mô mềm chứa tinh bột (2). Các tế bào mô cứng (3) thành dày, ống trao đổi rõ, hình dạng không nhất định, đa số là hình đa giác nhiều cạnh, có khi hình tròn (4); thường đứng rời nhau, có khi tụ lại thành đám. Sợi dài, thành hơi dày, nằm riêng lẻ hoặc tập trung thành bó
(5). Mảnh mạch chủ yếu là mạch điểm và mạch xoắn (10). Các tinh thể calci oxalat hình cầu gai nằm rải rác (7).
Hình 3.9. Một số đặc điểm bột rễ Đơn châu chấu
3.2. Nghiên cứu thành phần hóa học của Đơn châu chấu
3.2.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ trong cây Đơn châu chấu bằng phản ứng hóa học phản ứng hóa học
Tất cả các phản ứng định tính các nhóm chất hữu cơ đều được tiến hành lặp lại 3 lần.
Định tính saponin
Cho vào ống nghiệm dung tích 20ml khoảng 1g bột dược liệu, thêm vào 5ml nước, đun sôi nhẹ, lọc dịch lọc vào một ống nghiệm to và lắc mạnh theo chiều dọc ống trong 5 phút, để yên quan sát.
Kết quả: cột bọt xuất hiện và bền trong 15 phút ở cả ba mẫu rễ, thân, lá Đơn châu chấu (phản ứng dương tính).
Phản ứng Salkowski
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết cồn. Để nghiêng ống nghiệm 450
, cho từ từ theo thành ống nghiệm 1ml acid sulfuric đặc.
Kết quả: cả ba mẫu rễ, thân, lá Đơn châu chấu đều xuất hiện vòng tím đỏ ở mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng (phản ứng dương tính).
Phản ứng phân biệt saponin
Lấy 2 ống nghiệm 10ml, cho vào ống thứ nhất 5ml HCl 0,1 N (pH=1) vào ống thứ hai 5ml NaOH 0,1 N (pH=13). Cho thêm vào mỗi ống 2-3 giọt dịch chiết cồn rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả 2 ống trong 3 phút. Ðể yên sau 15 phút.
Kết quả: sau 15 phút thấy cột bọt ở hai ống nghiệm đều cao ngang nhau ở cả ba mẫu rễ, thân, lá.
Kết luận sơ bộ: rễ, thân, lá Đơn châu chấu đều có saponin triterpenoid.
Định tính flavonoid
Cho 5g bột dược liệu vào bình nón, thêm 50ml cồn 900, đun cách thủy đến sôi trong 10 phút, lọc nóng. Dịch lọc thu được đem làm phản ứng định tính flavonoid.
Phản ứng Cyanidin
Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết cồn, thêm một ít bột magie và nhỏ từ từ 4-5 giọt dung dịch HCl đặc. Đun cách thủy trong 5 phút.
Kết quả: Dịch chiết không chuyển sang màu đỏ ở cả ba mẫu rễ, thân, lá (phản ứng âm tính).
Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%
Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết cồn, sau đó cho thêm 2-3 giọt dung dịch FeCl3 5%.
Kết quả: dung dịch chuyển sang màu xanh đen rõ ở cả ba mẫu rễ, thân, lá (phản ứng dương tính).
Phản ứng với dung dịch kiềm
Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết cồn, sau đó thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%. Ở cả ba mẫu rễ, thân, lá đều xuất hiện kết tủa vàng. Tiếp tục thêm 1ml nước cất, lắc đều lên.
Kết quả: tủa tan hết và màu vàng của dung dịch đậm lên (phản ứng dương tính).
Phản ứng với hơi NH3
Nhỏ 1-2 giọt dịch chiết cồn lên hai miếng giấy lọc, sấy nhẹ đến khô. Quan sát dưới ánh sáng thường thấy màu vàng. Đem hơ một miếng giấy lọc lên miệng lọ amoniac đặc đã mở nút.
Kết quả: ở cả ba mẫu rễ, thân, lá, màu vàng của dịch chiết trên tấm giấy lọc đem hơ đều đậm hơn so với vết dịch chiết trên tờ giấy lọc còn lại (phản ứng dương tính).
Phản ứng diazo hóa
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, thêm vào đó khoảng 2ml dung dịch natri hydroxyd 10%, thêm vài giọt thuốc thử diazoni mới pha, lắc đều, đun nóng cách thủy trong 5 phút.
Kết quả: dịch chiết rễ, thân, lá đều xuất hiện màu đỏ gạch (phản ứng dương tính).
Định tính coumarin
Lấy 10g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 250ml, thêm 100ml cồn 900
,đun cách thủy đến sôi trong 5 phút, lọc nóng qua giấy lọc. Các dịch chiết thu được đem làm các phản ứng sau:
Phản ứng mở và đóng vòng lacton
Cho vào 2 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml dịch lọc + Ống nghiệm 1: thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10% + Ống nghiệm 2: để nguyên
Đun cả hai ống nghiệm trên nồi cách thủy đến sôi. Quan sát thấy:
+ Ống nghiệm 1: xuất hiện tủa đục vàng + Ống nghiệm 2: trong suốt
Thêm vào cả 2 ống, mỗi ống 1ml nước cất, lắc đều
+ Ống 1: tủa tan, dung dịch trong suốt, màu vàng của dung dịch đậm lên.
+ Ống 2: không xuất hiện tủa đục
Thêm vào ống 1 vài giọt dung dịch HCl đặc
Kết quả: không thấy xuất hiện tủa đục ở cả ba mẫu rễ, thân, lá (phản ứng âm tính).
Phản ứng diazo hóa
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết ethanol, thêm 2ml NaOH 10%. Đun cách thủy sôi trong 5 phút, để nguội, nhỏ vài giọt thuốc thử diazo mới pha.
Kết quả: dịch chiết rễ, thân, lá đều xuất hiện màu đỏ gạch (phản ứng dương tính).
Nhỏ dịch chiết ethanol lên giấy lọc, sau đó nhỏ chồng lên 1 giọt NaOH 10%. Để khô, che nửa vết chất thử bằng 1 mảnh kim loại rồi đem soi dưới ánh sáng tử ngoại ở λ = 366 nm trong một phút, sau đó bỏ vật che ra, quan sát.
Kết quả: không có sự khác biệt về cường độ màu giữa hai nửa vết chất thử ở cả ba mẫu rễ, thân, lá (phản ứng âm tính).
Kết luận sơ bộ: rễ, thân, láĐơn châu chấu không có coumarin.
Định tính glycosid tim
Cho khoảng 10g bột dược liệu vào bình nón 250ml, thêm 50ml cồn 25o
, ngâm trong 24h. Lọc dịch chiết vào cốc có mỏ, đem loại tạp bằng dung dịch chì acetat 30% đến dư, khuấy đều, lọc lấy dịch lọc vào bình gạn, chiết lấy glycosid tim bằng cách lắc với chloroform (hai lần, 8ml/ lần), lắc kỹ, để tách lớp. Gạn lớp chloroform vào một cốc có mỏ đã sấy khô, loại nước bằng Na2SO4 khan, lọc. Chia đều dịch chiết vào 4 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô, bốc hơi dung môi trên nồi cách thủy đến khô. Cắn thu được làm các phản ứng sau:
Phản ứng Liebermann- Bouchard
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn. Đặt nghiêng ống nghiệm 450, cho từ từ theo thành ống 1ml dung dịch acid H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
Kết quả: ba mẫu rễ, thân, lá đều xuất hiện vòng tím đỏ ở bề mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng (phản ứng dương tính).
Phản ứng Baljet
Pha thuốc thử Baljet: cho vào ống nghiệm dung dịch acid picric 1%: NaOH 10% (1: 9) lắc đều.
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml dung dịch EtOH 900, lắc đều cho tan hết cắn.Thêm khoảng 0,5ml dung dịch thuốc thử Baljet mới pha. So với ống chứng (không có cắn).
Kết quả: cả ba mẫu rễ, thân, lá dung dịch đều có màu vàng chanh, hơi đục, không có màu đỏ cam (phản ứng âm tính).
Phản ứng Legal
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml dung dịch ethanol 900, lắc đều cho tan hết cắn. Thêm vài giọt dung dịch natrinitroprusiat 0,5% và hai giọt dung dịch NaOH 10%.
Kết quả: cả ba mẫu rễ, thân, lá các dung dịch đều có màu vàng, không có màu đỏ cam đậm hơn so với ống chứng (phản ứng âm tính).
Phản ứng Killer- Killiani ( phản ứng của phần đường 2,6- desoxy)
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml dung dịch EtOH 900, lắc đều cho tan hết cắn. Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% trong acid acetic. Lắc đều, để nghiêng ống nghiệm 450. Thêm từ từ 0,5ml dung dịch H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống nghiệm.
Kết quả: cả ba mẫu rễ, thân, lá đều thấy xuất hiện vòng tím đỏ ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng, lắc nhẹ lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá (phản ứng dương tính).
Kết luận sơ bộ: rễ, thân, lá Đơn châu chấu không có glycosid tim.
Định tính alcaloid
Chiết xuất: ở mỗi mẫu cân 5g bột dược liệu, cho vào bình nón dung tích 250 ml. Thêm 20ml dung dịch acid sulfuric 1N. Đun đến sôi, để nguội, lọc. Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac đặc (dùng chỉ thị màu vạn năng) đến pH= 9-10. Sau đó cho dịch lọc đã kiềm hóa vào bình gạn, lắc với Chloroform 3 lần, mỗi lần 10ml, gạn lấy lớp dung môi hữu cơ. Gộp dịch chiết chloroform lại, loại nước bằng natrisufat khan, sau đó lắc với dung dịch acid sulfuric 1N ba lần, mỗi lần 5ml. Lấy dịch chiết acid cho vào 4 ống nghiệm, mỗi ống 2ml. Nhỏ vào từng ống nghiệm 2-3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:
Kết quả: không có tủa trắng ở cả 3 mẫu rễ, thân, lá (phản ứng âm tính).
- Ống 2: Thuốc thử Bouchardat
Kết quả: không có tủa nâu ở cả 3 mẫu rễ, thân, lá (phản ứng âm tính). - Ống 3: Thuốc thử Dragendorff
Kết quả: không có tủa vàng ở cả 3 mẫu rễ, thân, lá (phản ứng âm tính).
Kết luận sơ bộ: rễ, thân, lá Đơn châu chấu không có alcaloid.
Định tính Anthranoid
Phản ứng Borntraeger
Cho 5g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100ml, thêm 30ml dung dich acid sulfuric 1N, đun sôi cách thủy trong 15 phút. Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp, lấy dịch lọc cho vào bình gạn dung tích 125ml. Chiết bằng 5ml chloroform, gạn lấy lớp chloroform cho vào ống nghiệm, bốc hơi dung môi còn khoảng 1ml, thêm 1ml amoniac 10%, lắc đều, không thấy xuất hiện màu hồng ở lớp trên, tiếp tục thêm vài giọt natri hydroxyd 10%.
Kết quả: cả ba mẫu rễ, thân, lá lớp nước không xuất hiện màu hồng (phản ứng âm tính).
Vi thăng hoa
Cho 1g dược liệu vào một nắp chai bằng nhôm, đậy bằng một phiến kính, trên có để một miếng bông tẩm nước lạnh. Hơ nắp nhôm trên bếp điện trong 10 phút. Để nguội, lấy phiến kính ra soi dưới kính hiển vi.
Kết quả: cả ba mẫu rễ, thân, lá đều không xuất hiện tinh thể hình kim (phản ứng âm tính).
Kết luận sơ bộ: rễ, thân, láĐơn châu chấu không có anthranoid.
* Định tính các thành phần trong dịch chiết nước
Lấy khoảng 10g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 20ml nước cất, đun sôi trong 5 phút. Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp. Dịch lọc để làm các phản ứng sau.
Định tính tanin
Ống 1: 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt FeCl3 5% (TT).
Kết quả: cả ba mẫu rễ, thân, lá đều xuất hiện tủa xanh đen (phản ứng dương tính).
Ống 2: 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt Pb(CH3COO)2 10% (TT).
Kết quả: cả ba mẫu rễ, thân, lá đều xuất hiện tủa bông trắng (phản ứng dương tính).
Ống 3: 2ml dịch lọc, thêm vài giọt dung dịch gelatin 1%.