Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.4.2. Phân lập các chất trong phân đoạn nước bằng sắc ký cột
Mục đích: Dùng sắc ký cột để phân lập các chất trong phân đoạn, dựa trên sự di chuyển của các cấu tử qua các xoang rỗng của pha tĩnh (sephadex) hay sự phân bố đồng thời vào hai pha lỏng không hỗn hòa với nhau hoặc sự hấp phụ của các chất vào chất hấp phụ (silica gel pha thường) và rửa giải bằng hệ dung môi thích hợp.
Tiến hành:
Sắc ký cột sephadex
Chuẩn bị cột sephadex: Chọn cột sắc ký kích thước 4 x 35 cm, lắp thẳng đứng trên giá, vặn khóa cột, lót 1 lớp bông sạch ở đáy cột. Sephadex ngâm trong MeOH được rót từ từ lên cột; dùng pipet rửa thành cột bằng MeOH; gõ đều hai bên cột bằng quả bóp cao su, sau đó để cột ổn định.
Chuẩn bị mẫu: Hòa tan 10,4 g (lưu mẫu 36.9 g) cắn của phân đoạn nước với lượng tối thiểu MeOH trong bình cầu, siêu âm cho tan hoàn toàn.
Đưa chất lên cột:
+ Mở khóa cột cho dung môi chảy từ từ đến khi lớp dung môi trong cột gần bề mặt chất hấp phụ.
+ Khóa cột, đưa từ từ mẫu lên thành cột, tránh xáo trộn cột.
+ Mở khóa cột, sau khi lớp chất gần bề mặt thoáng khóa cột lại, bổ sung nhẹ nhàng một lượng nhỏ dung môi MeOH đủ để tráng thành cột; khi lượng dung môi gần bề mặt chất hấp phụ, tiếp tục bổ sung dung môi và tiến hành rửa giải.
Rửa giải:
+ Sử dụng dung môi MeOH.
+ Điều chỉnh khóa cột sao cho tốc độ rửa giải khoảng 20 giọt/phút.
+ Dịch rửa giải được hứng vào các ống nghiệm đã đánh số thứ tự, mỗi ống hứng khoảng 20 ml.
+ Kiểm tra dịch rửa giải ở các ống nghiệm bằng SKLM, phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong EtOH, hơ nóng trên bếp điện.
+ Gộp các phần có sắc ký đồ tương tự nhau, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 3 phân đoạn (A1, A2, A3).
Sắc ký cột pha đảo
Khảo sát 3 phân đoạn thu được bằng SKLM, tiến hành phân lập bằng sắc ký cột pha đảo phân đoạn A2 (m = 2,57 g) với hệ dung môi aceton và nước. Sắc ký cột pha đảo được tiến hành qua 5 bước:
Bước 1: Chuẩn bị cột pha đảo.
Bước 2: Luyện cột với hệ aceton − nước (loại bỏ hết bọt khí) từ tỷ lệ 7 : 1 ~ 3 : 1.
Bước 3: Chuẩn bị mẫu.
Bước 4: Đưa mẫu lên cột.
Bước 5: Tiến hành rửa giải bằng hệ aceton − nước (siêu âm để loại bỏ hết bọt khí) từ tỷ lệ 3 : 1 đến 1 : 1.
Kiểm tra dịch rửa giải bằng SKLM, gộp các phần có sắc ký đồ giống nhau thu được 8 phân đoạn nhỏ (B2 ~ B9) từ phân đoạn A2.
Sắc ký cột pha thƣờng
Tiếp tục khảo sát 8 phân đoạn trên bằng SKLM hệ CHCl3 − MeOH (3 : 1), kết quả như trên hình 3.4.
UV 254 nm UV 366 nm H2SO4 10%/EtOH, t0
Trên sắc ký đồ, phân đoạn B5 (0,41 g) có các vết đậm và các vết có Rf chênh lệch lớn nên phân đoạn B5 được lựa chọn để tiến hành phân lập bằng sắc ký cột pha thường với hệ dung môi DCM − MeOH như sau:
+ Chuẩn bị mẫu: Hòa tan hoàn toàn 0,41 g cắn của phân đoạn B5 với lượng tối thiểu DCM trong bình cầu; thêm 0,41 g silica gel, lắc đều và để hấp phụ. Cất quay dưới áp suất giảm đến khô hoàn toàn. Sau đó, nghiền hỗn hợp rắn thu được trong cối sứ đến thể chất tơi xốp, đồng đều, không vón cục. Cảm quan hỗn hợp chất và silica gel khô tơi, màu đồng đều.
+ Chuẩn bị cột sắc ký: Cân 20 g silica gel (cỡ hạt 0,040 0,063 mm) cho vào cốc, thêm dung môi DCM, khuấy đều cho hết bọt khí; để yên 1 − 2 giờ. Rót từ từ hỗn dịch này lên cột, tráng dung môi nhiều lần để đưa hết silica gel lên cột. Mở khóa cột, đồng thời thêm dung môi phía trên, làm nhiều lần để ổn định cột. Khi cột đã ổn định, mức DCM trong cột cao hơn mức silica gel khoảng 3 5 mm, đưa hỗn hợp chất và silica gel đã chuẩn bị ở trên lên cột. Cho lên phía trên một lớp bông để tránh xáo trộn bề mặt khi bổ sung dung môi.
+ Giải hấp phụ: bằng hệ DCM − MeOH với tỷ lệ DCM giảm từ 100% 1%. Hứng các phân đoạn bằng ống nghiệm nhỏ, kiểm tra các phân đoạn này bằng SKLM, gộp các phần có sắc ký đồ tương tự nhau, thu được 6 phân đoạn (C1, C2, C3, C4, C5, C6).
Phân đoạn C5 thu được 23,9 mg chất màu trắng; ký hiệu là GA1.3. Lấy một lượng nhỏ GA1.3 hòa tan trong MeOH và tiến hành chấm SKLM với bản mỏng pha thường sử dụng các hệ dung môi khác nhau; quan sát ở bước sóng 254 nm thấy xuất hiện 1 vết màu xám, bước sóng 366 nm không bắt huỳnh quang. Nhúng bản mỏng trong dung dịch H2SO4 10%/EtOH, hơ nóng không có màu; dự đoán chất đã tinh khiết (Hình 3.6).
Hòa tan phân đoạn C2 (70,7 mg) trong lượng tối thiểu MeOH; tách lấy phần không tan và tiến hành rửa tủa nhiều lần bằng MeOH. Lấy một lượng nhỏ tủa đã rửa hòa tan bằng DMSO và tiến hành sắc ký trên bản mỏng tráng sẵn silica gel GF254 (Merck) đã hoạt hóa; sử dụng các hệ dung môi khác nhau, quan sát ở UV 254 nm
thấy xuất hiện 1 vết màu xám, UV 366 nm không bắt huỳnh quang. Nhúng bản mỏng trong dung dịch H2SO4 10%/ EtOH, hơ nóng không có màu, dự đoán chất đã tinh khiết. Cô phần tủa đã rửa thu được chất màu trắng (18,9 mg); ký hiệu là GL18 (Hình 3.6). Hình 3.5: Hình ảnh 2 chất GA1.3 và GL18 Hình 3.6 : Sắc ký đồ của GA1.3 và GL18 DCM – MeOH − H2O (5 : 1 : 0,1) Quá trình phân lập GA1.3 và GL18 được tóm tắt theo sơ đồ sau:
Hình 3.7: Sơ đồ phân lập GA1.3 và GL18