2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu là nấm Linh chi được thu hái từ tự nhiên vùng Tiên Phước, Quảng Nam Đà Nẵng.
Hình 2.1:Nấm Linh chi
2.1.2. Hóa chất
Các dung môi dùng trong chiết xuất là dung môi công nghiệp đã cất lại; các dung môi dùng cho kết tinh, tinh chế là dung môi tinh khiết của Trung Quốc.
Các dung môi, hóa chất dùng trong định tính (cồn 25%, cồn 800, nước cất, chì acetat 30%, chì acetat 10%, thuốc thử ninhydrin 3%, thuốc thử Fehling A và Fehling B, thuốc thử Lugol, thuốc thử natri nitroprussinat 0,5%, Na2SO4 khan, tinh thể Na2CO3, bột magie kim loại, anhydrid acetic, dung dịch gelatin 1%, cloroform, HCl đặc, amoniac đặc, dung dịch FeCl3 5%, dung dịch NaOH 5%) đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV.
Silica gel 60 (sắc ký cột pha thường), cỡ hạt 0,04 – 0,063 mm (Merck).
Silica gel pha đảo YMC (30 − 35 μm, FuJisilisa Chemical Ltd). − Sephadex LH-20 (sắc ký cột sephadex).
2.1.3. Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
Các dụng cụ dùng trong quá trình thực nghiệm như bình gạn, bình nón, phễu lọc, cốc có mỏ, ống nghiệm, ống đong, pipet,…
Bản mỏng silica gel GF254 (Merck).
Cột sắc ký.
Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (BUCHI).
Tủ sấy Memmert, Binder-FD115.
Bếp điện, bếp đun cách thủy.
Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR.
Đèn UV-Vilber lourmat, máy chụp ảnh UV.
Máy scan CanoScan LiDe 100.
Máy siêu âm Power sonic 405.
Máy đo:
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Brucker Avance 500 Hz.
Phổ khối lượng (MS): Hewlett Packard HP 5890, Serie II.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu thực vật
2.2.1.1. Giám định tên khoa học
Mẫu nấm Linh chi tươi sau khi thu hái được giám định tên khoa học (dựa trên các đặc điểm về thực vật và đối chiếu với các tài liệu chuyên khoa phân loại thực vật như: “Thực vật chí Việt Nam”, “Thực vật chí Trung Quốc”) tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.1.2. Phương pháp xử lý mẫu
Mẫu nấm Linh chi được thái lát mỏng và sấy ở nhiệt độ 500C 550C đến khối lượng không đổi. Mẫu sau khi được sấy khô lưu một lượng nhỏ, bảo quản trong túi nilon kín, lượng còn lại tiến hành chiết bằng dung môi MeOH công nghiệp.
Hình 2.2: Dƣợc liệu nấm Linh chi
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu hóa học
2.2.2.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong nấm Linh chi
Khảo sát sơ bộ các nhóm chất chính trong dược liệu bằng phương pháp hóa học theo tài liệu [2], [3].
2.2.2.2. Phương pháp chiết xuất
Chiết dược liệu (chiết nóng): Dược liệu sấy khô chiết nóng bằng MeOH (tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1 : 15), ở nhiệt độ 650C trong thời gian 3 giờ x 3 lần; sau đó, gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm (ở nhiệt độ 600C) tới cắn.
Chiết các phân đoạn: Hòa tan cắn MeOH vào một lượng tối thiểu nước nóng, sau đó chiết lần lượt với các dung môi với tỷ lệ 1 : 1 (3 lần) theo thứ tự tăng dần độ phân cực: n-hexan, dicloromethan, n-butanol. Thu các phần dịch chiết, rồi đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm tới cắn.
2.2.2.3. Phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất tách từ nấm Linh chi chi
Phân lập bằng sắc ký cột:
+ Lựa chọn phân đoạn nước để tiến hành sắc ký.
+ Tiến hành lần lượt qua 3 cột sắc ký: sắc ký cột sephadex (chất hấp phụ sephadex LH-20, dung môi rửa giải là MeOH); sắc ký cột pha đảo (chất hấp phụ
silica gel pha đảo YMC, hệ dung môi rửa giải là aceton và H2O (tỷ lệ 3 : 1 đến 1 : 1)); sắc ký cột pha thường (chất hấp phụ silica gel 60 (cỡ hạt 0,04 – 0,063 mm). Hệ dung môi khai triển là DCM và MeOH tăng dần độ phân cực (lượng MeOH từ 0% đến 10%)).
+ Độ tinh khiết của chất phân lập được kiểm tra sơ bộ bằng SKLM, phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong EtOH.
Xác định cấu trúc: Sử dụng các phương pháp phân tích phổ (phổ khối ESI-MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H/13C-NMR, phổ DEPT), tham khảo cơ sở dữ liệu phổ của các tài liệu đã công bố để biện giải cấu trúc chất phân lập được.