Cân khoảng 3g dược liệu cho vào ống nghiệm to, thêm 5ml nước cất, đun sôi. Lọc qua giấy lọc vào 1 ống nghiệm khác. Thêm 1ml dung dịch thuốc thử Felling A và 1ml dung dịch Felling B. Đun cách thủy sôi vài phút. Phản ứng dương tính khi xuất hiệu tủa đỏ gạch.
Kết quả: Phản ứng dương tính
Sơ bộ kết luận: Dược liệu có chứa đường khử.
3.1.4.10. Định tính acid amin
Cân khoảng 3g dược liệu cho vào cốc có mỏ, thêm 20ml nước cất, đun sôi vài phút. Lọc qua giấy lọc vào 1 ống nghiệm khác. Thêm vài giọt thuốc thử Ninhydrin 3%. Đun cách thủy sôi vài phút. Phản ứng dương tính khi xuất hiệu màu xanh đến tím.
Kết quả: Xuất hiện màu xanh đậm (phản ứng dương tính)
Sơ bộ kết luận: Dược liệu có chứa acid amin.
3.1.4.11. Định tính polysaccharid
Chuẩn bị dịch chiết như đối với phản ứng định tính acid amin. Chia dịch chiết vào 3 ống nghiệm:
Ống 1: 4ml dịch chiết + 5 giọt thuốc thử Lugol Ống 2: 4ml nước cất + 5 giọt thuốc thử Lugol Ống 3: 4ml dịch chiết.
Phản ứng dương tính nếu màu ở ống 1 đậm hơn ống 2 và ống 3.
Kết quả: Ống 1 chuyển thành màu xanh đậm (phản ứng dương tính)
Sơ bộ kết luận: Dược liệu có chứa polysaccharid.
Cân khoảng 10g bột dược liệu vào cốc cỏ mỏ 100ml, thêm 10ml ether dầu hỏa, bọc kín, ngâm 12 giờ. Lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc. Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên mảnh giấy trắng, sấy nhẹ cho bay hết hơi dung môi, phản ứng dương tính khi để lại vết mờ trên giấy.
Kết quả: Phản ứng âm tính.
Sơ bộ kết luận: Dược liệu không chứa chất béo.
3.1.4.13. Định tính caroten
Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2ml dịch chiết ether dầu hỏa của dược liệu, cô cách thủy đến cắn, nhỏ vài giọt H2SO4 đặc vào cắn.
Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu xanh lá.
Kết quả: Phản ứng âm tính.
Sơ bộ kết luận: Dược liệu không chứa caroten.
3.1.4.14. Định tính sterol
Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2ml dịch chiết ether dầu hỏa của dược liệu, cô cách thủy đến cắn. Thêm vào ống nghiệm khoảng 1ml anhydride acetic, lắc kỹ cho tan hết cắn. Để nghiêm ống nghiệm 450, thêm từ từ H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm.
Phản ứng dương tính nếu mặc phân cách có vòng tím đỏ, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá.
Kết quả: Phản ứng dương tính.
Sơ bộ kết luận: Dược liệu có chứa sterol.
3.1.4.15. Định tính iridoid
Cân khoảng 3g bột dược liệu vào ống nghiệm to, thêm 10 dung dịch HCl 1% ngâm trong 5 giờ. Lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc. Cho vào ống
nghiệm nhỏ 1ml dịch lọc trên, thêm 1ml thuốc thử Trim-Hill (10ml acid acetic + 1ml CuSO4 0,2% + 0,5ml HCl đặc). Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu xanh.
Kết quả: Phản ứng dương tính (xuất hiện màu xanh lá).
Sơ bộ kết luận: Dược liệu Xích đồng nam chứa iridoid.
Sau khi tiến hành định tính các nhóm chất trong dược liệu Xích đồng nam thu được kết quả tổng kết ở bảng sau
Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất trong dược liệubằng phương pháp hóa học
STT Nhóm chất Phản ứng với thuốc thử Kết quả
1 Glycosid
+ P/ư Liebermann +
+ P/ư Legal -
+ P/ư Baljet -
+ P/ư Keller-Kiliani - 2 Saponin Hiện tượng tạo bọt +++ 3 Anthranoid + P/ư vi thăng hoa -
+ P/ư Borntraeger - 4 Flavonoid + P/ư Cyanidin ± + dd NaOH +++ + Hơi NH3 +++ + dd FeCl3 5% +++ 5 Coumarin + P/ư mở, đóng vòng lacton ++ + P/ư diazo hóa ± + P/ư di chuyển dạng đồng phân cis-trans -
6 Tanin + Chì acetat +++ + FeCl3 +++ + dd gelatin 1% - 7 Alcaloid + TT Mayer - + TT Bouchardat - + TT Dragendoff - 8 Acid hữu cơ + P/ư với bột Na2CO3 - 9 Đường khử + TT Felling A,B +++ 10 Acid amin + TT ninhydrin 0,1% +++ 11 Polysaccharid + TT Lugol +++ 12 Caroten + TT H2SO4 đậm đặc - 13 Sterol + P/ư Liebermann ++ 14 Chất béo + Để vết mờ trên giấy lọc - 15 Iridoid + TT Trims-Hill + Ghi chú: +++ Phản ứng dương tính rất rõ ++ Phản ứng dương tính rõ + Phản ứng dương tính - Phản ứng âm tính ± Phản ứng không rõ 3.1.5. Sắc ký lớp mỏng *Tiến hành Chuẩn bị dịch chiết chấm sắc ký:
Cho 5g dược liệu vào bình nón, thêm methanol ngập dược liệu. Đun hồi lưu cách thủy trong vòng 1 giờ. Lọc lấy dịch chiết methanol, cô đến nồng độ thích hợp đem chấm sắc ký.
Dịch chiết methanol thêm dung dịch HCl 5%, đun hồi lưu cách thủy trong 2 giờ. Lọc lấy dịch lọc cho vào bình gạn. Thêm cloroform 3 lần, mỗi lần 5ml, lắc kỹ. Gộp các dịch chiết chloroform, đem cô đến nồng độ thích hợp rồi đem chấm sắc ký.
Chấm sắc ký bằng máy chấm sắc ký Linomat
* Hệ dung môi: Thăm dò khả năng tách vết trên các hệ dung môi khác nhau để tìm ra hệ có khả năng tách tốt nhất
Hệ 1: Toluen - Ethylacetat (7:3) Hệ 2: Toluen - Ethylacetat (6:5)
Hệ 3: Toluen - Ethylacetat - Acid formic (5:4:1) Hệ 4: Toluen - Ethylacetat - Acid formic (5:4:0,5) Hệ 5: Cloroform – Ethylacetat - Acid formic (5:4:1)
* Kết quả: Thu được hình ảnh sắc ký đồ
Hình 3.4. Sắc ký đồ dịch chiết Cloroform thân Xích đồng nam với hệ dung môi Toluen - Ethylacetat - Acid formic (5:4:1) ở:
a. λ=254 nm b. λ=366 nm
Hình 3.5. Sắc ký đồ dịch chiết Cloroform thân Xích đồng nam với hệ dung môi Toluen - Ethylacetat (7:3) ở:
a. λ=254 nm b. λ=366 nm
c. phun thuốc thử hiện màu
Hình 3.6. Sắc ký đồ dịch chiết Methanol thân Xích đồng nam với hệ dung môi Toluen - Ethylacetat (7:3) ở:
a. λ=254 nm b. λ=366 nm
Đối với dịch chiết toàn phần MeOH thân Xích đồng nam triển khai SKLM bằng hệ dung môi Toluen – Ethylacetate - Acid formic (5:4:1) khi phân tích bằng phần mềm thu được kết quả như hình sau:
Hình 3.8. Sắc ký đồ, đồ thị và bảng biểu diễn các giá trị dịch chiết Methanol thân Xích đồng nam với hệ dung môi Toluen – Ethyacetate - Acid formic (5:4:1) ở λ=254nm
Hình 3.9. Sắc ký đồ, đồ thị và bảng biểu diễn các giá trị dịch chiết Methanol thân Xích đồng nam với hệ dung môi Toluen – Ethyacetate - Acid formic (5:4:1) ở λ=366nm
Hình 3.10. Sắc ký đồ, đồ thị và bảng Rf dịch chiết Methanol thân Xích đồng nam với hệ dung môi Toluen - Ethyacetate - Acid formic (5:4:1) khi phun thuốc thử hiện màu Vanilin/Ethanol/H2SO4
3.1.6. Xác định chỉ số bọt
*Chỉ số bọt: Là số ml nước để hòa tan saponin trong 1g nguyên liệu cho một cột bọt cao 1cm sau khi lắc và đọc (tiến hành trong điều kiện quy định).
*Tiến hành: cân 5g bột nguyên liệu, cho vào bình nón có thể tích 250ml đã chứa sẵn 100ml nước sôi, giữ sôi nhẹ trong 30 phút, lọc, để nguội và thêm nước cho đúng 100ml. Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16 cm và đường kính 16 mm, cho vào các ống nghiệm lần lượt 1,2,3,…,10ml nước sắc, thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ mỗi ống 10ml. Bịt miệng các ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc trong 15 giây, mỗi giây 2 lần lắc. Để yên 15 phút và đo chiều cao của các cột bọt.
*Kết quả: ống 10 (chứa 10ml nước sắc) có cột bọt chiều cao 1cm. Ống này chứa 10ml nước sắc nồng độ 5% tương ứng 0,5g bột. Chỉ số bọt là:
10.1/0,5=20 3.1.7. Tro toàn phần
* Tiến hành:
Lấy một chén sứ nung tới đỏ trong 30 phút. Để nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Lấy 1 g mẫu thử rải đều vào chén nung, sấy 1 giờ ở 100 – 105 °C rồi đem nung trong lò nung ở 600 ± 25 °C trong 4h. Sau mỗi lần nung, lấy chén nung cùng cắn tro đem làm nguội trong bình hút ẩm rồi cân.
Trong quá trình thao tác không được để tạo thành ngọn lửa. Nếu sau khi đã nung lâu mà vẫn chưa loại hết carbon của tro thì dùng nước nóng để lấy cắn ra, lọc qua giấy lọc không tro rồi lại nung cắn và giấy lọc trong chén nung. Hợp dịch lọc vào tro ở trong chén, làm bốc hơi cẩn thận tới khô rồi nung đến khối lượng không đổi.
1 2 100 m xm X
Trong đó m1: Khối lượng mẫu thử m2: Khối lượng tro
* Kết quả: Kết quả thu được thể hiện ở bảng sau
Bảng 3.2. Kết quả Tro toàn phần dược liệu Xích đồng nam
m1(g) m2(g) X (%) Lần 1 1.1003 0.0448 4,07 Lần 2 1.1462 0.0464 4,05 Lần 3 1.0180 0.0483 4,74 Lần 4 1.1229 0.0493 4,39 Lần 5 1.1678 0.0546 4,68 Lần 6 1.0324 0.0571 5,53 Trung bình 4,6
3.1.8. Xác định lƣợng chất chiết đƣợc trong dƣợc liệu theo phƣơng pháp chiết nóng
Sử dụng dung môi chiết là ethanol
*Tiến hành:
Cân chính xác khoảng 2,000 - 4,000g bột dược liệu có cỡ bột nửa thô cho vào bình nón 250ml. Thêm chính xác 50,0ml ethanol, đậy kín, cân xác định khối lượng, để yên 1 giờ, sau đó đun hồi lưu trong cách thủy 1 giờ, để nguội, lấy bình nón ra, đậy kín, cân để xác định lại khối lượng, dùng cồn để bổ sung phần khối lượng bị giảm, lọc qua phễu lọc khô vào một bình hứng khô thích hợp. Lấy chính xác 25,0ml dịch lọc vào một cốc thủy tinh đã cân bì trước, cô trong cách thủy đến cắn khô, cắn thu được sấy ở 105°C trong 3 giờ, lấy ra để
nguội trong bình hút ẩm 30 phút, cân nhanh để xác định khối lượng cắn. Tính phần trăm lượng chất chiết được bằng ethanol theo dược liệu khô.
Lượng chất chiết được trong dược liệu tính theo công thức:
2 1
100xm X
m
Trong đó: m1: Khối lượng mẫu thử
m2:Khối lượng cắn
*Kết quả: kết quả thu được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.3. Kết quả xác định lượng chất chiết được trong dược liệu Xích đồng nam bằng phương pháp chiết nóng
m1(g) m2(g) X (%) Lần 1 3,1543 0,2548 8,08 Lần 2 3,2486 0,2406 7,41 Lần 3 3,0098 0,2454 8,15 Lần 4 3,1246 0,2412 7,72 Lần 5 3,1189 0,2504 8,03 Lần 6 3,2643 0,2450 7,51 Trung bình 7,8 3.1.9. Xác định độ ẩm
* Nguyên tắc: Sấy dược liệu tới khối lượng không đổi ở 100-1050C, khối lượng mẫu thử mất đi là khối lượng nước.
Độ ẩm (X%) của dược liệu được tính theo công thức sau:
P: Số gam của mẫu thử trước khi sấy A: Số gam của mẫu thử sau khi sấy
x100 P
A P X%
*Tiến hành: Xác định độ ẩm dược liệu bằng máy xác định độ ẩm Sartorius. Rải một lượng bột dược liệu khoảng 0,5-1g thành một lớp mỏng trên đĩa cân của máy. Đậy nắp và đọc kết quả cuối cùng sau khi quá trình xác định hàm ẩm kết thúc.
*Kết quả:
Bảng 3.4. Kết quả xác định độ ẩm dược liệu Xích đồng nam Độ ẩm (%) Lần 1 10,70 Lần 2 12,07 Lần 3 11,56 Trung bình 11,4 3.2. Bàn luận
Khi triển khai sắc ký trên các hệ dung môi khác nhau, nếu sử dụng dung môi chiết để chấm sắc ký là Cloroform thu được số lượng vết nhiều hơn cũng như màu sắc vết đậm hơn so với khi sử dụng dịch chiết Methanol toàn phần để chấm sắc ký. Vì vậy, có thể cân nhắc sử dụng dịch chiết Cloroform (chiết theo phương pháp đã nêu trong phần thực nghiệm) thay cho dịch Methanol toàn phần khi định tính bằng SKLM.
Với những kết quả đã thu được, chúng tôi đề xuất chuyên luận về Xích đồng nam như sau:
XÍCH ĐỒNG NAM (Thân)
Caulis Cledrodendrii japonicii
Các đoạn thân, cành hoặc các lát thân đã phơi hay sấy khô của cây Xích đồng nam (Clerodendrum japonicum (Thunb.) Sweet)
Mô tả
Dược liệu là những đoạn thân và cành dài chừng 2 – 8cm hoặc các lát thân (nếu là cây lâu năm) có đường kính tùy thuộc vào độ tuổi của cây. Lát cắt thân già có hình tròn, cành và thân non có hình vuông. Vỏ ngoài thân có màu nâu xám, có các vân dọc theo thân, bên trong có màu trắng ngà, lõi xốp hoặc rỗng ở giữa.
Vi phẫu
Lát cắt thân có hình tròn. Từ ngoài vào trong gồm có: Ngoài cùng của thân già là lớp bần gồm nhiều hàng tế bào xếp đều đặn tạo thành nhiều vòng đồng tâm và các dãy xuyên tâm. Sát bần là mô mềm vỏ là những tế bào hình thoi, có thành mỏng. Tế bào mô cứng hình nhiều cạnh xếp thành vòng không liên tục ở ranh giới mô mềm vỏ và libe-gỗ. Tinh thể calci oxalat hình khối nằm trong các tế bào mô cứng hoặc rải rác gần các tế bào mô cứng. Bó libe-gỗ hình giải, xếp sát nhau thành vòng, libe ở ngoài, gỗ ở trong. Giữa các bó được ngăn cách nhau bởi các tia ruột. Mô mềm ruột gồm những tế bào hình tròn hay nhiều cạnh. Thân già thường khuyết ở trung tâm.
Bột
Có các mảnh biểu bì. Mảnh bần gồm các tế bào hình đa giác, thành tương đối dày. Rải rác có các mảnh mang màu. Mảnh mô mềm gồm những tế bảo thành mỏng, Đám tế bào mô cứng mang tinh thể calci oxalate hình khối, chữ nhật. Sợi dài, tập trung thành bó, đôi khi mang tinh bột. Mảnh mạch điểm rất nhiều, còn có các mạch xoắn.
Định tính
A. Lấy 1g bột dược liệu, thêm 5ml cồn, đun cách thủy 15 phút. Chuẩn bị 2 ống nghiệm cỡ bằng nhau, cho vào ống thứ nhất 5ml HCl 0,1 N (pH=1) và cho vào ống thứ hai 5ml NaOH 0,1N (pH=13). Cho thêm vào mỗi ống 1ml dung dịch cồn chiết rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả 2 ống trong 15 giây. Để yên. Thấy cả 2 ống đều có hiện tượng tạo bọt và ống kiềm có cột bọt cao hơn và bền vững hơn.
B. Cân khoảng 10g bột dược liệu vào cốc cỏ mỏ 100ml, thêm 10ml ether dầu hỏa, bọc kín, ngâm 1 giờ. Lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc. Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2ml dịch chiết ether dầu hỏa của dược liệu, cô cách thủy đến cắn. Thêm vào ống nghiệm khoảng 1ml anhydride acetic, lắc kỹ cho tan hết cắn. Để nghiêm ống nghiệm 45°, thêm từ từ H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm. mặt phân cách có vòng tím đỏ, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá.
5.4).
110o .
Dung dịch thử: Cho 5g dược liệu vào bình nón, thêm methanol ngập dược liệu. Đun hồi lưu cách thủy trong vòng 1 giờ. Lọc lấy dịch chiết methanol, cô đến nồng độ thích hợp đem chấm sắc ký.
Dung môi khai triển: Toluen - Ethylacetat - Acid formic(5:4:1)
Dung dịch đối chiếu: Lấy 5g dược liệu Xích đồng nam chuẩn, chuẩn bị dịch chiết methanol như đối với dung dịch thử.
Trên cùng một bản mỏng, chấm song song dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Sau khi triển khai sắc ký, để khô, soi ở bước sóng λ=254nm và λ=366nm. Sau đó hiện màu bằng thuốc thử Vanilin/Ethanol/H2SO4. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết cùng màu và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.
Độ ẩm
Không quá 12% (Phụ lục 9.6)
Tro toàn phần
Không quá 5% (Phụ lục 9.8)
Chỉ số bọt
Cân 5g bột nguyên liệu, cho vào bình nón có thể tích 250ml đã chứa sẵn 100ml nước sôi, giữ sôi nhẹ trong 30 phút, lọc, để nguội và thêm nước cho đúng 100ml. Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16 cm và đường kính 16 mm, cho vào các ống nghiệm lần lượt 1,2,3,…,10ml nước sắc, thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ mỗi ống 10ml. Bịt miệng các ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc trong 15 giây, mỗi giây 2 lần lắc. Để yên 15 phút và đo chiều cao của các cột bọt.
Chỉ số bọt của dược liệu vào khoảng 20.
Chất chiết đƣợc trong dƣợc liệu
Cân chính xác khoảng 2,000 - 4,000g bột dược liệu có cỡ bột nửa thô cho vào bình nón 250ml. Thêm chính xác 50,0ml cồn, đậy kín, cân xác định khối lượng, để yên 1 giờ, sau đó đun hồi lưu trong cách thủy 1 giờ, để nguội, lấy bình nón ra, đậy kín, cân để xác định lại khối lượng, dùng cồn để bổ sung phần khối lượng bị giảm, lọc qua phễu lọc khô vào một bình hứng khô thích hợp. Lấy chính xác 25,0ml dịch lọc vào một cốc thủy tinh đã cân bì trước, cô