- Làm mềm dược liệu bằng cách ngâm với hồn hợp cồn-nước (1:1), cắt bằng dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay, chọn các lát cắt mỏng.
- Tấy lát cắt dược liệu bằng Cloramin B đã pha bão hòa tới khi lát cắt trắng hoàn toàn để tẩy sạch các chất trong tế bào, chỉ giữ lại màng tế bào và tinh thể nhằm quan sát tiêu bản dễ hơn.
- Rửa sạch nhiều lần bằng nước cất.
- Ngâm Cloralhydrat trong 10 phút để tẩy tinh bột khoai còn dính trên lát cắt. - Rửa lại nhiều lần bằng nước.
- Ngâm lát cắt trong dung dịch acid acetic 5% để tấy Clorid của Cloramin B và Cloralhydrat còn sót lại.
- Nhuộm Xanh methylen (đã pha loãng theo tỷ lệ 1:4) trong 5 phút. - Rửa sạch nhiều lần bằng nước cất.
- Nhuộm đỏ son phèn trong 30 phút. - Rửa sạch nhiều lần bằng nước cất.
- Đặt vi phẫu vào một giọt nước cất trên phiến kính, đậy lamen, soi trên kính hiển vi.
* Kết quả:
Đặc điểm vi phẫu thân Xích đồng nam (Hình 3.2 trang 19) Mô tả:
Thân già: Lát cắt thân có hình tròn. Từ ngoài vào trong gồm có: Ngoài cùng của thân già là lớp bần gồm nhiều hàng tế bào xếp đều đặn tạo thành nhiều vòng đồng tâm và các dãy xuyên tâm (1). Sát bần là mô mềm vỏ là những tế bào hình thoi, có thành mỏng (2). Tế bào mô cứng (3) hình nhiều cạnh xếp thành vòng không liên tục ở ranh giới mô mềm vỏ và libe-gỗ. Tinh thể calci oxalat hình khối nằm trong các tế bào mô cứng hoặc rải rác gần các tế bào mô cứng. Bó libe-gỗ hình giải, xếp sát nhau thành vòng, libe (4) ở ngoài, gỗ (5) ở trong. Giữa các bó được ngăn cách nhau bởi các tia ruột. Mô mềm ruột (6)
gồm những tế bào hình tròn hay nhiều cạnh. Thân già thường khuyết ở trung tâm.
Hình 3.2. Vi phẫu thân Xích đồng nam
1.Bần, 2.Mô mềm vỏ, 3.Tế bào mô cứng, 4.Libe, 5.Gỗ, 6.Mô mềm ruột
3.1.3.Đặc điểm vi học bột dƣợc liệu * Tiến hành:
Sấy khô dược liệu trong tủ sấy ở nhiệt độ 60°C sau đó dùng dao cầu cắt nhỏ rồi nghiền bằng thuyền tán. Rây lấy bột mịn, dùng kim mũi mác lấy bột dược liệu cho lên phiến kính đã nhỏ sẵn một giọt nước cất, đặt lamen lên và quan sát dưới kính hiển vi. Xác định những đặc điểm vi học của bột Xích đồng nam và chụp lại bằng máy ảnh.
* Kết quả :
- Đặc điểm vi học bột thân Xích đồng nam:
+ Đặc điểm bột: bột màu vàng, có mùi đặc biệt, vị nhạt. + Soi kính hiển vi thấy:
Có các mảnh biểu bì. Mảnh bần gồm các tế bào hình đa giác, thành tương đối dày. Rải rác có các mảnh mang màu. Mảnh mô mềm gồm những tế bảo thành mỏng, Đám tế bào mô cứng mang tinh thể calci oxalate hình khối, chữ nhật. Sợi dài, tập trung thành bó, đôi khi mang tinh bột. Mảnh mạch điểm rất nhiều, còn có các mạch xoắn.
Hình 3.3. Bột dược liệu Xích đồng nam
1&2. Mảnh biểu bì, 3&6. Bần, 4. Mảnh mô mềm, 5. Mảnh mang màu, 7. Mảnh mô cứng mang tinh thể Calci oxalate, 8&9. Bó sợi, 10. Mảnh mạch điểm, 11&12. Mảnh mạch xoắn.
3.1.4. Sơ bộ định tính các nhóm chất có trong dƣợc liệu bằng phản ứng hóa học
3.1.4.1. Phản ứng định tính Glycosid tim
*Tiến hành:
Cân khoảng 5g bột dược liệu đã tán nhỏ cho vào một bình nón dung tích 250ml. Thêm 100ml cồn 25% rồi ngâm trong 24 giờ. Gạn dịch chiết vào
cốc có mỏ dung tích 100ml. Thêm vào dịch chiết 3ml chì acetat 30%, khuấy đều. Lọc qua giấy lọc gấp nếp vào một cốc có mỏ dung tích 100ml. Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat. Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng 1ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat.
Chuyển toàn bộ dịch lọc vào một bình gạn dung tích 100ml. Chiết glycosid tim bằng cách lắc với cloroform 2 lần, mỗi lần 8ml. Gạn lớp cloroform vào một cốc có mỏ đã được sấy khô. Gộp các dịch chiết cloroform và loại nước bằng natrisulfat khan.
Chia đều dịch chiết vào 6 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô. Đặt các ống nghiệm lên giá và bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô. Cắn thu được đem tiến hành làm các phản ứng định tính.
a. Phản ứng của khung steroid: Phản ứng Liebermann - Burchardat
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn. Nghiêng ống 450. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
Phản ứng dương tính nếu ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện một vòng màu tím đỏ. Lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên có màu xanh lá.
Kết quả: Phản ứng dương tính (xuất hiện vòng màu tím đỏ).
b. Phản ứng của vòng lacton 5 cạnh
- Phản ứng Baljet
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet (1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%) mới pha. Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ da cam. Khi so sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn
Kết quả: Phản ứng âm tính. - Phản ứng Legal
Chuẩn bị 1 ống chứng. Cho vào ống nghiệm chứa cắn đã chuẩn bị ở trên và ống chứng mỗi ống 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ 1 giọt thuốc thử Natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc đều.
Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ cam. Khi so sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn glycosid tim thấy ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng.
Kết quả: Phản ứng âm tính.
c. Phản ứng của phần đường 2,6 - desoxy: Phản ứng Keller - Kiliani
Cho vào ống nghiệm chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic. Lắc đều. Nghiêng ống 450. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
Phản ứng dương tính khi ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện 1 vòng màu tím đỏ. Khi lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía trên sẽ có màu xanh lá.
Kết quả: Phản ứng âm tính.
Sơ bộ kết luận: Dược liệu Xích đồng nam không chứa glycosid tim.
3.1.4.2. Định tính Saponin trong Dược liệu
a. Dựa trên tính chất tạo bọt: Đây là tính chất đặc trưng nhất của saponin do phân tử saponin lớn và có cùng một lúc một đầu ưa nước và một đầu kỵ nước. Người ta dựa trên hiện tượng gây bọt ở môi trường kiềm và acid để sơ bộ phân biệt saponin steroid và triterpenoid: lấy 1g bột dược liệu, thêm 5ml cồn, đun cách thủy 15 phút.
Chuẩn bị 2 ống nghiệm cỡ bằng nhau, cho vào ống thứ nhất 5ml HCl 0,1 N (pH=1) và cho vào ống thứ hai 5ml NaOH 0,1N (pH=13). Cho thêm vào mỗi ống 1ml dung dịch cồn chiết rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả 2 ống trong 15 giây. Để yên và đọc kết quả sau 1 phút, nếu cột bọt trong cả 2 ống cao ngang nhau và bền như nhau thì sơ bộ xác định trong dược liệu có saponin triterpenoid. Nếu ống kiềm có cột bọt cao hơn ống kia thì sơ bộ xác định là saponin steroid.
Kết quả: Cả 2 ống đều có hiện tượng tạo bọt và cột bọt trong ống kiềm cao hơn ống acid.
Sơ bộ kết luận: Dược liệu Xích đồng nam có chứa saponin steroid.
3.1.4.3. Định tính hợp chất anthranoid trong dược liệu
a. Phản ứng Borntraeger
Nguyên tắc của phản ứng: Các hợp chất anthranoid khi tác dụng với kiềm (amoniac, natri hydroxyd hoặc kali hydroxyd) sẽ tạo các dẫn chất phenolat có màu đỏ sim tan trong nước.
Định tính dạng tự do: *Tiến hành:
Lấy 2g bột dược liệu cho vào ống nghiệm lớn (10ml). Thêm 5ml nước cất. Đun trực tiếp với nguồn nhiệt cho đến sôi. Lọc dịch chiết còn nóng qua một lớp bông mỏng vào trong bình gạn dung tích 50ml. Làm nguội dịch lọc. Thêm 5ml cloroform. Lắc nhẹ. Gạn bỏ lớp nước. Giữ lớp cloroform để làm phản ứng.
- Lấy 1ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1ml dung dịch amoniac 10%. Lắc nhẹ. Phản ứng dương tính nếu lớp nước có màu đỏ sim. Nếu lớp cloroform có màu vàng chứng tỏ trong dược liệu có chứa acid
chrysophanic. Thêm tiếp tục từng giọt dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ. Lớp dung môi hữu cơ sẽ mất màu vàng, còn lớp nước sẽ đỏ thẫm hơn lúc ban đầu. - Lấy 1ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ. Nếu lớp nước có màu đỏ sim thì phản ứng dương tính.
Kết quả: Phản ứng âm tính
Định tính anthranoid toàn phần (dạng glycosid và dạng tự do) *Tiến hành
Cho vào ống nghiệm lớn 2g dược liệu . Thêm 5ml dung dịch acid sulfuric 1N. Đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến sôi. Tiếp tục lọc và chiết như ở trên. - Lấy 1ml dịch chiết cloroform, thêm 1ml dung dịch amoniac. Lắc nhẹ. Phản ứng dương tính nếu lớp nước sẽ có màu đỏ sim. Nếu lớp chloroform có màu vàng thì tiếp tục nhỏ từng giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc nhẹ. Lớp cloroform sẽ mất màu còn lớp nước thì màu sẽ đỏ đậm hơn.
- Lấy 1ml dịch chiết chloroform cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%. Lắc nhẹ. Lớp nước sẽ có màu đỏ sim.
Kết quả: Phản ứng âm tính.
c. Vi thăng hoa:
Trải bột dược liệu thành lớp mỏng trong một nắp chai bằng nhôm, đốt nhẹ trên đèn cồn để loại nước. Sau đó đậy lên nắp nhôm một miếng lam kính, bên trên có miếng bông đã thấm nước, tiếp tục đun nóng trong khoảng 5 - 10 phút. Lấy lam kính ra để nguội, soi kính hiển vi.
Kết quả: Không nhìn thấy tinh thể.
Sơ bộ kết luận: Dược liệu Xích đồng nam không chứa anthranoid.
Cân 4g bột dược liệu rồi cho vào cốc có mỏ. Thêm 10ml ethanol 90%. Đun cách thủy sôi trong vài phút. Lọc nóng. Dịch lọc được tiến hành các phản ứng định tính: phản ứng Cyanidin, phản ứng với kiềm, phản ứng với FeCl3, phản ứng diazo hóa.
a. Phản ứng Cyanidin (Phản ứng Shinoda)
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm một ít bột magnesi kim loại (khoảng 10mg). Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3 - 5 giọt). Đun cách thủy sôi vài phút, phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ.
Kết quả: Phản ứng không rõ ràng.
b. Phản ứng với kiềm
- Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Phản ứng dương tính nêu khi thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% sẽ thấy xuất hiện tủa vàng. Thêm 1ml nước cất, tủa sẽ tan và màu vàng của dung dịch sẽ được tăng thêm.
Kết quả: Phản ứng dương tính.
- Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc. Hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nút, phản ứng dương tính sẽ thấy màu vàng của vết dịch chiết được tăng lên. Nhỏ một giọt khác trên giấy lọc làm chứng.
Kết quả: Phản ứng dương tính rõ.
c. Phản ứng với FeCl3
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm vài giọt dung dịch FeCl3
5%.
Kết quả: Xuất hiện tủa xanh đen (Phản ứng dương tính).
d. Phản ứng diazo hóa
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm (dung dịch NaOH, KOH, Na2CO3), thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều,
đun nóng trên nồi cách thủy trong vài phút. Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ.
Kết quả: Phản ứng không rõ ràng.
Nhận xét: Các phản ứng dương tính không đặc hiệu nên sơ bộ kết luận dược liệu Xích đồng nam không chứa flavonoid.
3.1.4.5. Định tính coumarin
Cân 4g bột dược liệu rồi cho vào cốc có mỏ. Thêm 10ml ethanol 90%. Đun cách thủy sôi trong vài phút. Lọc nóng. Dịch lọc được dùng để làm các phản ứng.
a. Phản ứng mở đóng vòng lacton :
Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết Ống 1 thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10% Ống 2 để nguyên.
Phản ứng dương tính khi xảy ra các hiện tượng sau: - Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi. Để nguội rồi quan sát
Ống 1: Có màu vàng hoặc tủa đục màu vàng Ống 2: Trong
- Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2ml nước cất. Lắc đều rồi quan sát Ống 1: Trong suốt
Ống 2: Có tủa đục
Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, ống 1 sẽ trở lại tủa đục như ống 2.
Kết quả: Phản ứng dương tính.
b. Phản ứng diazo hóa
Tiến hành và kết quả tương tự phần định tính flavonoid (phản ứng không rõ ràng).
c. Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm (Phản ứng chuyển từ đồng phân cis sang đồng phân trans dưới tác dụng của tia tử ngoại)
Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy thấm. Nhỏ tiếp vài giọt dung dịch NaOH 5%. Sấy nhẹ. Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một miếng kim loại (chìa khóa, đồng xu) rồi chiếu tia tử ngoại trong một vài phút. Bỏ miếng kim loại ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại.
Phản ứng dương tính khi phần không bị che có huỳnh quang sáng hơn phần bị che. Tiếp tục chiếu tia tử ngoại, phần bị che sẽ sáng dần lên, sau vài phút cả hai phần đều phát quang như nhau.
Kết quả: Phản ứng âm tính.
Nhận xét: Phản ứng mở đóng vòng lacton (đặc hiệu) dương tính nhưng 2 phản ứng còn lại âm tính. Sơ bộ kết luận dược liệu không chứa coumarin.
3.1.4.6. Định tính tanin
Lấy khoảng 3g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 20ml nước cất, đun sôi trong 2 phút. Để nguội, lọc. Dịch lọc được dùng để định tính.
a. Ống 1: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% (TT). Phản ứng dương tính sẽ xuất hiện màu hoặc tủa màu xanh đen hoặc xanh nâu nhạt. b. Ống 2: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10% (TT). Phản ứng dương tính sẽ xuất hiện tủa bông.
c. Ống 3: lấy 2ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1%. Phản ứng dương tính sẽ xuất hiện tủa bông trắng.
Kết quả: ống 1 và ống 2 dương tính, ống 3 âm tính.
Nhận xét: Phản ứng dương tính không đặc hiệu nên sơ bộ kết luận dược liệu Xích đồng nam không chứa tanin.
3.1.4.7. Định tính alcaloid
Cân 5g bột dược liệu, cho vào bình nón dung tích 50ml. Thêm 15ml dung dịch acid sulfuric 1N. Đun đến sôi. Để nguội. Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100ml. Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N (khoảng 8ml) đến pH = 9 - 10 (thử bằng giấy quỳ hoặc chỉ thị màu vạn năng). Chiết alcaloid base bằng cloroform (chiết 3 lần, mỗi lần 5ml). Gộp các dịch chiết cloroform, loại nước bằng natrisulfat khan, sau đó dùng để làm phản ứng định tính.
Lấy một phần dịch chiết cloroform đã được chuẩn bị ở trên, đem lắc với acid sulfuric 1N hai lần, mỗi lần 5ml. Gộp các dịch chiết nước. Chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml. Nhỏ vào từng ống nghiệm 2- 3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:
- Ống 1: thuốc thử Mayer, phản ứng dương tính nếu cho tủa màu từ trắng đến vàng
- Ống 2: thuốc thử Bouchardat, phản ứng dương tính nếu cho tủa nâu đến đỏ nâu
- Ống 3: thuốc thử Dragendorff, phản ứng dương tính nếu cho tủa vàng cam đến đỏ.
Kết quả: Cả 3 phản ứng đều âm tính.
Sơ bộ kết luận: Dược liệu không chứa alcaloid.
3.1.4.8. Định tính acid hữu cơ
Cân khoảng 3g bột dược liệu cho vào ống nghiệm to, thêm 10ml nước cất đem đun sôi trực tiếp 10 phút, để nguội rồi lọc qua giấy lọc gấp nếp. Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2ml dịch lọc, thêm một ít tinh thể Na2CO3. Phản ứng dương tính nếu có bọt khí thoát ra.
Kết quả: Phản ứng âm tính.
3.1.4.9. Định tính đường khử
Cân khoảng 3g dược liệu cho vào ống nghiệm to, thêm 5ml nước cất, đun sôi. Lọc qua giấy lọc vào 1 ống nghiệm khác. Thêm 1ml dung dịch thuốc thử Felling A và 1ml dung dịch Felling B. Đun cách thủy sôi vài phút. Phản ứng dương tính khi xuất hiệu tủa đỏ gạch.