24
- Sử dụng các phương pháp thực nghiệm cơ bản trong hóa học hữu cơ để tổng hợp các chất dự kiến.
- Dùng SKLM để theo dõi tiến triển của phản ứng. Soi đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm để nhận biết vết sắc ký.
- Xác định độ tinh khiết của các sản phẩm tổng hợp được bằng phương pháp SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy.
2.3.2. Xác định cấu trúc
Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được dựa trên kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR), Phổ khối lượng phân tử (MS), Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H – NMR).
Phổ hồng ngoại (IR):
Được ghi tại phòng Phân tích hữu cơ - Viện hóa học Việt Nam, trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-400cm-1. Mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1:200 rồi ép dưới dạng viên nén dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm.
Dải hấp thụ nằm trong vùng 1640-1590 cm-1 đặc trưng cho liên kết C=N; vùng 1512-1403 cm-1 đặc trưng cho liên kết C=C và vùng 1371-1257 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-N.
Dải hấp thụ trong vùng 3179-3136 cm-1 đặc trưng cho liên kết N-H.
Dải hấp thụ trong vùng 1750-1738 cm-1 đặc trưng cho liên kết C=O, vùng 1220-1179 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-O.
Phổ khối lượng phân tử (MS):
Được ghi theo chế độ không phân mảnh (ESI) trên máy Autospec Premier tại khoa Hóa Trường Đại học Khoa học tự nhiên - Hà Nội và trên máy Agilent 6310 Ion Trap tại phòng Phân tích hữa cơ - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam. Phổ cộng hưởng từ
25
Được ghi trên máy Bruker AV-500 tại phòng Phân tích phổ - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.
Độ dịch chuyển hóa học của proton vòng thơm của các chất dao động trong khoảng 7,09-7,65 ppm
Độ dịch chuyển hóa học của proton nhóm CH2 trong liên kết -CH2-S- dao động trong khoảng 3,33-3,62 ppm.
Độ dịch chuyển hóa học của proton nhóm CH2 trong liên kết -CH2-N- dao động trong khoảng 4,04-5,35 ppm.
2.3.3. Thử tác dụng sinh học
Thử tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn:
Thử tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm tiến hành theo phương pháp khuếch tán trên thạch, thực hiện tại bộ môn Vi sinh- Sinh học của Trường Đại học Dược Hà Nội
2.3.3.1. Nguyên tắc
Thử tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm được tiến hành theo phương pháp khuếch tán trên thạch. Mẫu thử (có chứa hoạt chất thử) được đặt lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy vi sinh vật kiểm định, hoạt chất từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn hoặc vòng vô nấm.
2.3.3.2. Cách tiến hành
a. Các vi sinh vật sử dụng trong thử nghiệm
Bộ môn Vi sinh - Sinh học, Trường Đại học Dược Hà Nội tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn với 5 vi khuẩn Gram (+) và 5 vi khuẩn Gram (-), thử tác dụng kháng nấm với 4 vi nấm:
+ Vi khuẩn Gram (-) gồm:
- Escherichiacoli ATCC 25922 (EC)
- Proteusmirabilis BV 108 (Pro)
26
- Salmonellatyphi DT 220 (Sal)
- Pseudomonas aeruginosa VM 201 (Pseu)
+ Vi khuẩn Gram (+) gồm:
- Staphylococcusaureus ATCC 1128 (Sta)
- Bacilluspumilus ATCC 10241 (Bp)
- Bacillussubtilis ATCC 6633 (Bs)
- Bacillus cereus ATCC 9946 (Bc)
- SarcinaluteaATCC 9341 (SL)
+ Vi nấm kiểm định gồm:
- Candida albicans (Ca)
- Aspergillus niger (As)
- Saccaromyces ceravitiae (Sa)
- Penicilium sp. (Pe)
Kháng sinh đối chiếu: Streptomycin (Strep) 14µg/ml và Penicillin (Peni) 27 UI/ml đối với thử nghiệm kháng khuẩn và Itraconazol (Itra) 50µg/ml đối với thử nghiệm kháng nấm.
b. Môi trường thử nghiệm
Bảng 2.3.Các môi trường trong thử nghiệm kháng khuẩn và kháng nấm.
Kháng khuẩn Kháng nấm Canh thang nuôi cấy VK Thạch thường Sabouraud lỏng nuôi cấy C. albicans Thử nghiệm Sabouraud - NaCl 0,5% - Cao thịt 0,3% - Pepton 0,5% - Nước vừa - NaCl 0,5% - Thạch 1,6% - Pepton 0,5% - Nước vừa - Pepton 1,0% -Glucose 2,0% - Nước vừa đủ 100ml. - Pepton 1,0% - Glucose 2,0% - Thạch 1,6%
27
đủ 100ml. đủ 100ml. - Nước vừa đủ 100ml.
+ Đánh giá kết quả: Dựa trên đường kính vòng vô khuẩn hoặc vòng vô nấm và được đánh giá theo công thức:
2 1 1 ( ) 1 n n i i i i D D D D s n n
D: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn hoặc vòng vô nấm, Di: Đường kính vòng vô khuẩn hoặc vòng vô nấm thứ i,
s : Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh, n : số thí nghiệm làm song song (n=3).
Thử tác dụng kháng tế bào ung thư:
Theo phương pháp của Skehan & cộng sự ( 1990 ) và Likhiwitayawuid & cộng sự ( 1993) hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư quốc gia của Mỹ (NCI) và Trường Đại học Dược, đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ, thực hiện tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên- phòng Sinh học thực nghiệm.
Dòng tế bào thử: Dòng Hep-G2: Ung thư gan và dòng MCF7: ung thư biểu mô vú.
Môi trường nuôi cấy tế bào: DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)
hoặc MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt). Có bổ sung L- glutamine, Sodium piruvat, NaHCO3, PSF(Penixillin- Streptomycin sulfate- Fungizone); NAA (Non-Essential Amino Acids); 10% BCS (Bovine Calf Serum).Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfoside); TCA(Trichloro Acetic acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamine B); Acid Acetic.
28
pipet pasteur, các đầu tuýp cho micropipet…
Chất chuẩn chứng dương tính: Dùng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào: Ellipithine, Vinblastine hoặc Taxol pha trong DMSO.
Đọc trên máy ELISA ở bước sóng 495-515nm
Tính kết quả: Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử tính theo % so với đối chứng. Dựa trên kết quả đo được của chúng OD (ngày 0), DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS(%) theo công thức:
OD (mẫu) – OD (ngày 0)
CS% = x 100 OD (DMSO) – OD (ngày 0)
Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên, đựơc đưa vào tính toán Excel để tìm ra % trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn của phép thử được lặp lại 3 lần theo công thức của Ducan như sau: Độ lệch tiêu chuẩn
(xi - x )2 =
n-1
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS < 50%) sẽ được chọn ra để thử nghiệm tiếp để tìm giá trị IC50
Giá trị IC50 : dùng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chương trình Table curve theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng
độ chất thử để tính giá trị IC50.(Mẫu tinh có IC50 ≤ 10µg là có hoạt tính) Công thức: 1/y=a+blnX
Trong đó Y: nồng độ chất thử; X: Giá trị CS (%)
29
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. Tổng hợp hóa học
Thông qua các tài liệu tham khảo và dựa vào điều kiện của phòng thí nghiệm, các hóa chất cho phép, chúng tôi đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất của 2- mercaptobenzimidazol đi từ nguồn nguyên liệu ban đầu là o-phenylendiamin theo sơ đồ sau:
30
31
3.1.1. Tổng hợp 2-mercaptobenzimidazol (chất II)
Phương pháp của Van Allan và Deacon :
Sơ đồ 3.2:Sơ đồ tổng hợp 2-mercaptobenzimidazol [25].
Tiến hành: Cho vào bình cầu hỗn hợp gồm có: 7,03g (65 mmol) O-
phenylendiamin và 3,64g (65 mmol) KOH, 70ml ethanol, 12ml nước cất, sau đó thêm từ từ 3,93ml (65 mmol) carbon disulfid (CS2) và thêm vài viên đá bọt (để làm hỗn hợp phản ứng sôi đều). Tiến hành hồi lưu trong 3 giờ. Theo dõi tiến triển phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi là dicloromethan: methanol (20: 1) và hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm.
Xử lý hỗn hợp phản ứng: Sau khi phản ứng kết thúc, thêm vào hỗn hợp phản ứng 0,7g than hoạt, tiếp tục đun trong vòng 10 phút, sau đó lọc nóng và rửa 3 lần bằng ethanol (bỏ than hoạt và đá bọt). Dịch thu được thêm 70ml nước nóng (60-70oC), acid hóa đến pH khoảng 5-6, tiếp tục khuấy khoảng 1 giờ. Lọc lấy tủa (rửa bằng nước cất) và sấy khô dưới đèn hồng ngoại, thu được sản phẩm thô. Tinh chế bằng cách kết tinh lại trong EtOH 50%, thu được 9,15g sản phẩm.
Kết quả: - Cảm quan: sản phẩm là tinh thể hình phiến mỏng, màu trắng bạc
- Nhiệt độ nóng chảy tonc 302-3060C [25]
- Hiệu suất phản ứng 93,89%, Rf (CH2Cl2: CH3OH=20:1)=0,32. 3.1.2. Tổng hợp các dẫn chất của 2-mercaptobenzimidazol.
3.1.2. 3.1.2.1. Tổng hợp 2-benzylthio-1H-benzo[d]imidazol (chất III)
32
Sơ đồ 3.3: Tổng hợp 2-benzylthio-1H-benzo[d]imidazol
Tiến hành: Cho hỗn hợp gồm: 3 g (0,02 mol) 2-mercaptobenzimidazol (II); 2,9 g K2CO3 khan và 70 ml aceton vào trong bình cầu 2 cổ dung tích 100 ml, kết hợp khuấy từ. Thêm từ từ 2,3 ml (0,02 mol) benzylclorid vào hỗn hợp trên, khuấy ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Sau đó hồi lưu hỗn hợp trên trong 7 giờ. Theo dõi tiến triển phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 100:1, hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm.
Xử lý hỗn hợp sau phản ứng: Hỗn hợp sau khi kết thúc phản ứng được làm nguội đến nhiệt độ phòng rồi lọc loại bỏ muối vô cơ. Dịch lọc được thêm 40ml nước cất, khuấy kỹ, sẽ xuất hiện tủa màu trắng. Sau đó lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước cất (15ml x 3 lần), sấy tủa ở nhiệt độ 50-60°C, thu được 3,60g sản phẩm.
Kết quả: - Cảm quan: sản phẩm là bột màu trắng, xốp.
- Nhiệt độ nóng chảy: tonc 186-1870C.
- Hphản ứng =75%. Rf (CH2Cl2:CH3OH=100:1) =0,67.
3.1.2.2.Tổng hợp 1-benzyl-2-(benzylthio)-1H-benzo[d]imidazol (chất III-a).
Sơ đồ phản ứng:
Sơ đồ 3.4: Tổng hợp 1-benzyl-2-(benzylthio)-1H-benzo[d]imidazol
Tiến hành: Thêm 0,5 g (2 mmol) 2-benzylthio-1H-benzo[d]imidazol (III) và 0,5 g K2CO3 khan trong 10 ml DMF khan vào bình cầu 2 cổ dung tích 100 ml,
33
kết hợp khuấy từ. Thêm từ từ 0,14 ml (2 mmol) benzylclorid vào hỗn hợp trên. Khuấy ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Sau đó đun hỗn hợp trên ở nhiệt độ 110 Co trong 20 giờ. Theo dõi tiến triển phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 100:1, hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm.
Xử lý hỗn hợp sau phản ứng: Hỗn hợp sau khi kết thúc phản ứng được làm nguội đến nhiệt độ phòng rồi lọc loại bỏ muối vô cơ. Dịch lọc được thêm 30 ml nước cất và khuấy kỹ khoảng 4 giờ. Xuất hiện tủa màu trắng, lọc lấy tủa, rửa bằng nước cất (10 ml x 3 lần). Sấy tủa ở 50-60°C, thu được 0,62g sản phẩm.
Kết quả: - Cảm quan: sản phẩm là bột màu trắng, xốp.
- Nhiệt độ nóng chảy: tonc 80-900C.
- Hphản ứng =90,18%. Rf (CH2Cl2:CH3OH=100:1) =0,86.
3.1.2.3. Tổng hợp methyl 2-(2-(benzylthio)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)acetat ( chất III-b).
Sơ đồ phản ứng
Sơ đồ 3.5: Tổng hợp methyl 2-(2-(benzylthio)-1H-benzo[d]imidazol-1- yl)acetat
Tiến hành: Cho vào bình cầu dung tích 50 ml hỗn hợp gồm: 0,5 g (2 mmol) 2-benzylthio-1H-benzo[d]imidazol (III), 0,5 g K2CO3 và 10 ml DMF khan, khuấy ở nhiệt độ phòng. Thêm từ từ 0,183 ml (2 mmol) methyl cloroacetat (MCA) vào hỗn hợp trên. Khuấy tiếp hỗn hợp trên ở nhiệt độ thường trong 1 giờ. Sau đó đun hỗn hợp trên ở nhiệt độ 105oC trong 5 giờ. Theo dõi tiến triển phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi dicloromethan:methanol=100:1, hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254
34
nm.
Xử lý hỗn hợp sau phản ứng: Hỗn hợp sau phản ứng được xử lý bằng cách lọc loại bỏ K2CO3, dịch lọc được thêm 20 ml nước cất lạnh kết hợp khuấy từ. Sau đó chiết bằng ethyl acetat 3 lần, mỗi lần 10 ml. Sau đó thêm nước cất kết hợp khuấy từ mạnh ở nhiệt độ phòng cho tủa màu trắng. Lọc lấy tủa và rửa bằng nước cất (10 ml x 3 lần). Sấy khô tủa, thu được 0,35g sản phẩm.
Kết quả: - Cảm quan: sản phẩm là bột màu trắng.
- Nhiệt độ nóng chảy: tonc 58-590C.
- Hphản ứng =53,93%. Rf (CH2Cl2:CH3OH=100:1) =0,77.
3.1.2.4. Tổng hợp ethyl 2-(2-(benzylthio)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)acetat (chất III-c).
Sơ đồ phản ứng:
Sơ đồ 3.6: Tổng hợp ethyl 2-(2-(benzylthio)-1H-benzo[d]imidazol-1- yl)acetat
Tiến hành: Cho vào bình cầu dung tích 50 ml hỗn hợp gồm: 0,5 g (2 mmol) 2-benzylthio-1H-benzimidazol (III); 0,5 g K2CO3và 10 ml DMF khan khuấy ở nhiệt độ phòng. Thêm từ từ 0,214 ml (2 mmol) ethyl cloroacetat( ECA) vào hỗn hợp trên. Khuấy tiếp hỗn hợp trên ở nhiệt độ thường trong 1 giờ. Sau đó đun hỗn hợp trên ở nhiệt độ 105o
C trong 5 giờ. Theo dõi tiến triển phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi dicloromethan: methanol=100: 1, hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm.
Xử lý hỗn hợp sau phản ứng: Hỗn hợp sau phản ứng được xử lý bằng cách lọc loại bỏ K2CO3 và dịch lọc được thêm 20 ml nước lạnh kết hợp khuấy từ. Sau đó chiết bằng ethyl acetat 3 lần, mỗi lần 10 ml. Dịch chiết được làm khan
35
qua đêm bằng 5g Na2SO4 . Lọc, cất loại ethyl acetat. Sau đó thêm nước cất kết hợp khuấy từ mạnh ở nhiệt độ phòng cho tủa màu trắng. Lọc lấy tủa và rửa bằng nước cất (10 ml/ lần x 3 lần). Sấy khô tủa, thu được 0,33g sản phẩm
Kết quả: - Cảm quan: sản phẩm là bột màu trắng.
- Nhiệt độ nóng chảy: tonc 62-630C. - Hphản ứng =50,61%. Rf (CH2Cl2:CH3OH=100:1) =0,76. 3.1.2.5. Tổng hợp 1,4-bis(2-(benzylthio)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)butan (chất III-d) Sơ đồ tổng hợp: Sơ đồ 3.7: Tổng hợp 1,4-bis(2-(benzylthio)-1H-benzo[d]imidazol-1- yl)butan.
Tiến hành: Cho vào bình cầu dung tích 50 ml hỗn hợp gồm: 0,3 g (1,32 mmol) 2-benzylthio-1H-benzimidazol (III); 0,3 g K2CO3; 15 ml C2H5OH tuyệt đối; kết hợp khuấy từ. Thêm từ từ 0,078 ml (0,66 mmol) 1,4-dibromobutan vào hỗn hợp. Tiến hành đun hồi lưu trong 14h. Theo dõi tiến triển phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi dicloromethan: methanol=20: 1, hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm.
Xử lý hỗn hợp sau phản ứng: Thêm 50 ml nước cất vào hỗn hợp sau phản ứng để hòa tan hết K2CO3, đồng thời khuấy từ qua đêm xuất hiện tủa vàng. Lọc thu tủa thô. Tủa này được kết tinh lại trong 3 ml MeOH. Lọc thu tinh thể và rửa lại bằng MeOH lạnh. Sấy thu được 0,27g sản phẩm.
Kết quả: - Cảm quan: sản phẩm là tinh thể màu trắng, hơi vàng.
- Nhiệt độ nóng chảy: tonc 166-1680C.
36
3.1.2.6. Tổng hợp ethyl 2-(1H-benzimidazol-2-ylthio)acetat (chất IV)
Sơ đồ tổng hợp:
Sơ đồ 3.8: Tổng hợp ethyl 2-(1H-benzimidazol-2-ylthio)acetat
Tiến hành: Cho vào bình cầu dung tích 50 ml hỗn hợp gồm : 0,3g (2 mmol) 2-mercaptobenzimidazol (II); 0,3g K2CO3; 15 ml aceton. Khuấy từ ở nhiệt độ phòng. Thêm 0,22 ml ECA(2 mmol) vào hỗn hợp trên, tiếp tục khuấy ở nhiệt độ phòng 24h. Theo dõi tiến triển phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi dicloromethan: methanol=20: 1, hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm.
Xử lý hỗn hợp sau phản ứng: Thêm 50 ml nước cất vào hỗn hợp sau phản ứng để hòa tan hết K2CO3, kết hợp khuấy từ 5h ở nhiệt độ thường. Lọc thu tủa, kết tinh lại tủa trong 3 ml EtOH 96%. Để qua đêm trong tủ lạnh sau đó lọc thu tinh thể. Sấy thu được 0,29g sản phẩm.
Kết quả: - Cảm quan: sản phẩm là tinh thể hình kim, màu trắng.
- Nhiệt độ nóng chảy: tonc 102-1030C. - Hphản ứng =61,44%. Rf (CH2Cl2:CH3OH=20:1) =0,56. 3.1.2.7. Tổng hợp 1,4-bis(2-benzimidazolthio)butan (chất V) Phương trình phản ứng : Sơ đồ 3.9:Tổng hợp 1,4-bis(2-benzimidazolthio)butan.
37
mercaptobenzimidazol (II) trong 70ml ethanol tuyệt đối. Sau đó nhỏ từ từ 1,39ml (11,7 mmol) 1,4-dibromobutan vào dung dịch trên. Tiến hành hồi lưu trong 14 giờ. Theo dõi tiến triển phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi là dicloromethan: methanol (20: 1) và hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm.
Xử lý hỗn hợp sau phản ứng: Sau khi phản ứng kết thúc, bình cầu được để nguội về nhiệt độ phòng, thêm khoảng 50ml nước cất vào trong bình cầu và khuấy, kiềm hóa bằng cách vừa khuấy vừa nhỏ từ từ dung dịch NaOH 2N vào đến pH khoảng 12-13, sau đó tiến hành lọc lấy tủa, rửa tủa bằng ethanol lạnh. Sấy khô dưới đèn hồng ngoại và đem cân thì thu được 3,83g sản phẩm.
Kết quả: - Cảm quan: sản phẩm là bột màu trắng.