Với mong muốn các chất tổng hợp được có giá trị thực tiễn hơn nữa, chúng tôi đã tiến hành thử tác dụng gây độc tế bào của 11 chất tổng hợp được. Phép thử được thực hiện tại phòng sinh học thực nghiệm của Viện Hóa học các hợp
53
chất thiên nhiên.
Phương pháp phân tích : Theo phương pháp của Skehan & CS (1990) và
Likhiwitayawuid & CS(1993) hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI) và Trường Đại học Dược, Đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ.
Dòng tế bào: Dòng Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma - Ung thư gan),
Dòng MCF7: Ung thư biểu mô vú.
Bảng 3.8-3.9. Kết quả thử tác dụng kháng tế bào ung thư cho bởi bảng sau:
STT Ký hiệu mẫu Nồng độ mẫu (g/ml ) Dòng tế bào
Cell survival (%) Kết luận
Hep-G2 MCF7 DMSO 100,00, 0 100,00,0 Chứng (+) 10 1,20,3 0,70,09 Dương tính 1 M1 (V) 10 70,10,6 90,20,7 Âm tính 2 M2 (II) 10 79,50,7 96,71,1 Âm tính 3 M3 (V-a) 10 95,21,3 99,10,7 Âm tính 4 M4 (V-b) 10 97,30,4 92,41,3 Âm tính 5 M5 (V-c) 10 87,61,1 96,50,7 Âm tính 6 M6 (III-d) 10 59,30,5 80,60,4 Âm tính
7 M7 (III-a) 10 46,80,9 76,20,9 Dương tính với dòng Hep-G2
54 8 M8 (III) 10 99,20,7 98,70,5 Âm tính 9 M9 (III-b) 10 94,41,2 87,50,7 Âm tính 10 M10 (III-c) 10 98,71,5 99,50,9 Âm tính 11 M11 (IV) 10 97,60,3 99,20,6 Âm tính Bảng 3.9 STT Ký hiệu mẫu Dòng tế bào Giá trị IC50 (g/ml) Kết luận Hep-G2 MCF7 Chứng (+) 0,275 0,237 Dương tính
1 M7 (III-a) 9,471 >10 Dương tính với dòng Hep-G2
Với các mẫu M1đến M11 tương ứng với các chất V, II,V-a, V-b, V-c, III-d, III-a, III, III-b, III-c, IV.
Kết luận: như vậy chất III-a dương tính với dòng Hep-G2 hay chất này có tác dụng kháng lại tế bào ung thư gan.
55
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN
4.1. Về tổng hợp hóa học
Qua việc tổng hợp 11 chất: II, III, III(a, b,c, d), IV,V, V(a, b, c) chúng tôi rút ra một số nhận xét như sau:
a. Phản ứng đóng vòng tạo nhân 2-mercaptobenzimidazol
Phản ứng ngưng tụ của o-phenylendiamin với carbon disulfid diễn ra dễ dàng với hiệu suất khá cao. Cơ chế của phản ứng như sau:
NH2 NH2 C S S NH2 NH2 CS2 N NH2 C S S H H H N NH2 C SH S - H2S N H H N S N H N SH
Sơ đồ 4.1: Cơ chế phản ứng đóng vòng 2-mercaptobenzimidazol.
Trong phản ứng này, vai trò của xúc tác KOH có thể được giải thích như sau: Đầu tiên là hoạt hóa với dung môi ethanol tạo thành kali ethyl xanthat (CH3CH2OCS2K), sau đó phản ứng xảy ra giữa ion kali ethyl xanthat này với 1 nguyên tử nitơ của o-phenylendiamin như sơ đồ sau:
R NH2 NH2 EtOCS2K EtOH, H2O, R H N C NH2 S SK - H2S N H N SK R N H N SH R 2. AcOH, H2O CH3CH2OH + CS2 + KOH CH3CH2OCS2K + H2O
56
Một số yếu tố có thể ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng đóng vòng:
Tỷ lệ mol của CS2 và KOH sử dụng:
Thông qua nghiên cứu phản ứng này, phản ứng xảy ra tốt nhất khi sử dụng tỷ lệ mol giữa 3 chất là o-phenylendiamin : CS2 : KOH (1 : 1 : 1). Khi tăng hoặc giảm tỷ lệ CS2 hay KOH đều làm giảm hiệu suất phản ứng.
Nhiệt độ phản ứng:
Nhiệt độ phản ứng có ảnh hưởng đến hiệu suất và thời gian phản ứng. Nếu nhiệt độ thấp, phản ứng diễn ra chậm và không hoàn toàn. Nếu nhiệt độ quá cao sẽ tạo ra nhiều tạp do phản ứng oxy hóa amin, vì vậy sẽ làm giảm hiệu suất phản ứng.
Lượng than hoạt sử dụng, nhiệt độ và thời gian tẩy màu:
Thông thường trong quá trình tẩy màu lượng than hoạt sử dụng tốt nhất là 5- 10% so với lượng sản phẩm, nhiệt độ tốt nhất là 60oC và thời gian là 10 phút. Việc giảm hoặc tăng lượng than hoạt, nhiệt độ và thời gian tẩy màu đều làm giảm hiệu suất phản ứng.
b. Phản ứng tạo dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol.
Tỷ lệ mol:
Tỷ lệ mol giữa các chất tham gia phản ứng là rất quan trọng, vì nó quyết định đến việc tại thành sản phẩm mong muốn ở hiệu suất phản ứng, quá trình tinh chế.
- Để tạo thành các hợp chất II, IV tỷ lệ mol 2-mercaptobenzimidazol và tác nhân là 1:1. Tỷ lệ này nhỏ hơn hay lớn hơn 1 thì hỗn hợp sau phản ứng hoặc là thừa nhiều nguyên liệu hay tạo ra nhiều sản phẩm phụ đều gây khó khăn cho việc tinh chế thu sản phẩm.
- Phản ứng tạo chất III-d và V, V(a, b, c) rất dễ tạo sản phẩm phụ là dẫn chất mono. Chính vì vậy tỷ lệ mol giữa nguyên liệu và tác nhân là rất quan trọng.
Nhiệt độ:
57
quá cao hoặc quá thấp đều làm giảm hiệu suất phản ứng. Khi nhiệt độ phản ứng thấp, phản ứng xảy ra chậm, không hoàn toàn nên hiệu suất thấp. Khi nhiệt độ quá cao có thể làm tăng quá trình tạo muối amoni bậc 4 trên N3, do đó làm giảm hiệu suất phản ứng.
Thời gian của phản ứng:
Cần phải theo dõi phản ứng trong suốt thời gian diễn ra phản ứng, nếu thời gian không đủ sẽ làm giảm hiệu suất phản ứng hay phản ứng kéo dài có thể tạo điều kiện thuận lợi để hình thành các sản phẩm phụ.
Lưu ý: phản ứng alkyl hóa này phải tiến hành trong điều kiện khan nước. Nếu trong hỗn hợp phản ứng có nước thì tác nhân alkyl hóa dễ bị thủy phân, do đó sẽ làm giảm hiệu suất phản ứng.
4.2. Về xác định cấu trúc:
Dựa trên kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR) của các chất tổng hợp được cho phép chúng tôi kết luận các chất mà chúng tôi tổng hợp được tinh khiết và có cấu trúc đúng như dự kiến.
Về phổ hồng ngoại (IR): xuất hiện các dải hấp thụ đặc trưng cho các nhóm chức và các liên kết điển hình của các chất tổng hợp được như liên kết N-H; C=O; C-O-C;C=S.
Cả 11 chất đều có dải hấp thụ nằm trong vùng 1640-1590 cm-1 đặc trưng cho liên kết C=N; vùng 1512-1403 cm-1 đặc trưng cho liên kết C=C và vùng 1371-1257 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-N.
Chất II, III, IV, V xuất hiện dải hấp thụ trong vùng 3179-3136 cm-1 đặc trưng cho liên kết N-H.
Chất III-b, III-c, IV, V-b, V-c xuất hiện dải hấp thụ trong vùng 1750-1738 cm-1 đặc trưng cho liên kết C=O, vùng 1220-1179 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-O.
58
phân tử, các pic phân tử này có số khối đúng bằng khối lượng phân tử tính theo công thức của chất dự kiến.
Về phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR): cho thấy sự có mặt của các
proton là phù hợp với công thức cấu tạo của các chất.
Độ dịch chuyển hóa học của proton vòng thơm của các chất dao động trong khoảng 7,09-7,65 ppm
Độ dịch chuyển hóa học của proton nhóm CH2 trong liên kết -CH2-S- dao động trong khoảng 3,33-3,62 ppm.
Độ dịch chuyển hóa học của proton nhóm CH2 trong liên kết -CH2-N- dao động trong khoảng 4,04-5,35 ppm.
4.3. Về thử tác dụng sinh học: Về tác dụng kháng khuẩn:
Có 4 chất III-a, III-d, V, V-a vừa có tác dụng trên chủng vi khuẩn G(+) vừa có tác dụng trên chủng vi khuẩn G(-) thử. Trong đó các chủng vi khuẩn này nhạy cảm với chất III-a nhất.
Chất III-b chỉ có tác dụng trên chủng vi khuẩn G(+) còn V-b, V-c lại chỉ có tác dụng trên chủng vi khuẩn G(-).
Các chất III, III-c, IV không có tác dụng kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn thử.
Về tác dụng kháng nấm:
Có 5 chất III-c, III-d, V, V(a, b) có tác dụng trên 2 chủng vi nấm là
Candida albicans, Saccaromyces ceravitiae.
Có 5 chất III, III(a, b) có tác dụng trên chủng vi nấm Saccaromyces
ceravitiae, IV,V-c có tác dụng chủng vi nấm hoặc Candida albicans.
Không có chất nào đem thử có tác dụng trên Aspergillus niger và Penicilium sp.
Về hoạt tính gây độc tế bào:
59
tế bào ung thư gan và tế bào ung thư vú thì chỉ có chất III-a có tác dụng kháng lại tế bào ung thư gan.
60
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận:
Từ những kết quả nghiên cứu trình bày trên đây, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:
Đã tổng hợp được 11 chất bao gồm chất 2-mercaptobenzimidazol (II) và các chất dẫn:
Chất III: 2-benzylthio-1H-benzo[d]imidazol.
Chất III-a: 1-benzyl-2-(benzylthio)-1H-benzo[d]imidazol.
Chất III-b: Methyl 2-(2-(benzylthio)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)acetat. Chất III-c: Ethyl 2-(2-(benzylthio)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)acetat. Chất III-d: 1,4-bis(2-(benzylthio)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)butan. Chất IV: Ethyl 2-(1H-benzimidazol-2-ylthio)acetat. Chất V: 1,4-bis(2-benzimidazolthio)butan. Chất V-a:1,4-bis(1-benzyl-1H-benzo[d]imidazol-2-ylthio)butan. Chất V-b: 1,4-bis(1-methoxycarbonylmethyl-1H-benzo[d]imidazol)butan Chất V-c: 1,4-bis(1-ethoxycarbonylmethyl-1H-benzo[d]imidazol- 2ylthio)butan
Đã thử tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn và chống ung thư của các dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol tổng hợp được, trong đó
Có 4 chất III-a, III-d, V, V-a vừa có tác dụng trên chủng vi khuẩn G(+) vừa có tác dụng trên chủng vi khuẩn G(-) thử.
Chất III-b chỉ có tác dụng trên chủng vi khuẩn G(+) trong khi V-b, V-c lại chỉ có tác dụng trên chủng vi khuẩn G(-).
Có 5 chất III-c, III-d, V, V(a, b) có tác dụng trên 2 chủng vi nấm là
Candida albicans, Saccaromyces ceravitiae.
Có 5 chất III, III(a, b), IV,V-c có tác dụng chỉ trên 1 chủng vi nấm hoặc
Candida albicans hay Saccaromyces ceravitiae
61
tế bào ung thư gan và tế bào ung thư vú thì chỉ có chất III-a có tác dụng kháng lại tế bào ung thư gan.
Kiến nghị:
Với kết quả đạt được, chúng tôi hy vọng nghiên cứu này có thể đóng góp một phần vào việc làm phong phú hơn về tổng hợp và thử tác dụng sinh học của dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol ở Việt Nam. Do thời gian và điều kiện thử tác dụng sinh học có hạn chế, vì vậy để tiếp tục phát triển kết quả của đề tài này, chúng tôi đưa ra một số đề xuất sau:
1. Tiếp tục tổng hợp các dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol với các nhóm thế khác nhau ở vị trí C5, C6 và N1, S trên khung 2-mercaptobenzimidazol.
2. Tiếp tục thử nghiệm các hoạt tính sinh học triển vọng của dẫn chất 2- mercaptobenzimidazol như tác dụng kháng tế bào ung thư trên các dòng tế bào ung thư khác ngoài dòng tế bào ung thư gan và ung thư vú, tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm trên các chủng vi khuẩn, vi nấm khác, tác dụng hạ cholesterol máu…
62
PHỤ LỤC
Phụ lục 8: Phổ hồng ngoại (IR) của chất V.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Nguyễn Đình Luyện (2009), Kỹ thuật Hóa dược tập I, Bộ môn Công nghiệp Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội.
2. Nguyễn Hữu Đĩnh, Trần Thị Đà (1999), Ứng dụng một số phương pháp
phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử, NXB Giáo dục.
3. Trần Mạnh Bình (2003), Phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ, Đại học Dược Hà Nội.
Tiếng Anh
4. Akula Ganesh, Srinivas Bethi, Vidyasagar Matta, et al. (2011), "Synthesis of 3-(1H-Benzimidazol-2-yl Amino) 2-Phenyl-1,3-Thiazolidin -4-One as Potential CNS Depressant", International Journal of PharmTech Research, 3(1), pp. 360-364.
5. Alper Sabiha, Temiz Arpaci O., Sener Aki E., et al. (2003), "Some new bi - and ter - benzimidazole derivatives as topoisomerase I inhibitors", IL
Farmaco, 58, pp. 497-507.
6. Anandarajagopal K., Tiwari R.N., Bothara K.G., et al. (2010), "2- mercaptobenzimidazole derivatives: Synthesis and anticonvulsant activity",
Advances in Applied Science Research, 1(2), pp. 132-138.
7. Anandarajagopal K., Tiwari R.N, Venkateshan N., et al. (2010), "Synthesis and characterization of 2-mercaptobenzimidazole derivatives as potential analgesic agents", Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 2(3), pp. 230-236.
8.Aoki Kozo, Aikawa Kazuhiro (1999), "2-mercaptobenzimidazole derivatives and antihyperlipemic agent or antiarteriosclerotic agent containing the same", United States Patent Office, 5 962 493, pp. 1-52.
9. Armand G., Herve K., Narimene B., et al. (2008), "Synthesis and cytotoxicity evaluation of some benzimidazole-4,7-diones as bioreductive
anticancer agents", European Journal of Medicinal Chemistry, 43(9), pp. 1858-1864.
10. Ates-Alagoz Zeynep, Kus Canan, Coban Tulay (2005), "Synthesis and antioxidant properties of novel benzimidazoles containing substituted indole or 1, 1, 4, 4-tetramethyl-1, 2, 3, 4-tetrahydro-naphthalene fragments", Journal
of enzyme inhibition and medicinal chemistry, 20(4), pp. 325-331.
11. Bakhareva E.V, Voronkov M.G, Sorokin M.S, et al. (1996), "Synthesis and neurotropic properties of 2-(carboxymethylthio) derivatives of benzimidazole, benzothiazole and their ammonium salts", Pharmaceutical
chemistry journal, 30(2), pp. 89-91.
12. Can-Eke Benay, Puskullu M.O, Buyukbingol Erdem, et al. (1998), "A study on the antioxidant capacities of some benzimidazoles in rat tissues",
Chemico-biological interactions, 113(1), pp. 65-77.
13. Cho Sung Y., Kang Seung K., Kim Sung S., et al. (2001), "Synthesis and SAR of benzimidazole derivatives containing oxycyclic pyridine as a gastric H+/K+-ATPase Inhibitors", Bull. Korean Chem. Soc, 22(11), pp. 1217-1223. 14. Goker H., Ayhan-Kılcıgil G., Cbilek M.Tun, et al. (1999), Heterocycles, 51, pp. 2561.
15. Habernickel V.J. (1992), Drugs made in Germany, 35, pp. 97.
16. Iemura Ryuichi, Kawashima Tsuneo, Fukuda Toshikazu, et al. (1986), "Synthesis of 2-(4-substituted-1-piperazinyl) benzimidazoles as H1- antihistaminic agents", Journal of Medicinal Chemistry, 29(7), pp. 1178- 1183.
17. Kalidhar Uday, Kaur Amandeep (2011), "An Overview on Some Benzimidazole and Sulfonamide Derivatives with Anti-Microbial Activity",
Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, 2(4),
18. Khairnar V.L., Lockhande S.R., Patel M.R., et al. (1981), Chemical
Abstract, 95, 203833.
19. Kim Jung Sun, Sun Qun, GattoBarbar , et al. (1996), "Structure-activity relationships of benzimidazoles and related heterocycles as topoisomerase I poisons", Bioorganic & Medicinal Chemistry, 4(4), pp. 621-630.
20. Lazer Edward S. , Matteo Martha R., Possanza Genus J. (1987), "Benzimidazole derivatives with atypical antiinflammatory activity", Journal
of Medicinal Chemistry 30(4), pp. 726-729.
21. Lohray B.B., Lohray V.B., Guntupalli P., et al. (2000), "Benzimidazole derivatives as anti-ulcer agent, process for their preparation and pharmaceutical compositions containing them", United States Patent, 6 051