Các dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol thường được thế với tác nhân R’-X (X là halogen) tạo ra các nhóm thế khác nhau ở vị trí N-1, ở vị trí S ( S-alkyl hóa) trên nhân 2-mercaptobenzimidazol. Phản ứng thường được thực hiện trong các dung môi như: aceton, DMF, THF… Với các xúc tác base: natri hydrid, natri hydroxyd, kali carbonat khan [1, 8]…
Sơ đồ 1.4. Phản ứng alkyl hóa tạo dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol. 1.4.2.2. Phản ứng acyl hóa:
Phản ứng N-acyl hóa để thế vào vị trí của N của dẫn chất 2- mercaptobenzimidazol thường được tạo thành khi cho các dẫn chất trên tác dụng với clorid acid hoặc anhydrid acid và thực hiện trong môi trường khan của dung môi như sau: acetonitril, ethyl acetat, THF, DMF, DMAc,...với sự có mặt của xúc tác như: pyridin, triethylamin, K2CO3 khan,...Phản ứng N-acyl này có thể thực hiện ở nhiệt độ từ 30-150oC, nhưng nhiệt độ tốt nhất là từ 50-100o
C [1, 8]
20
1.4.2.3. Phản ứng ngựng tụ tạo hợp chất bis-2-mercaptobenzimidazol
Thông qua các tài liệu tham khảo, để tổng hợp hợp chất bis-2- mercaptobenzimidazol và dẫn chất thông thường sử dụng tác nhân Br-(CH2)n- Br và phản ứng được thực hiện trong những dung môi như: ethanol, aceton, acetonitril, ethyl acetat, DMF, THF...với sự có mặt của xúc tác base như: NaOH, K2CO3, C2H5ONa, triethylamin... Phản ứng này cũng có thể xảy ra trong môi trường ethanol và nhiệt độ với sự vắng mặt của bất kỳ những xúc tác nào đó ở trên. Nhiệt độ để thực hiện phản ứng này tùy thuộc vào bản chất của chất tham gia phản ứng và dung môi, thông thường là từ 0-150oC nhưng tốt nhất là từ 20-100oC. Còn nếu phản ứng thực hiện trong môi trường ethanol với sự vắng mặt của chất xúc tác thì nhiệt độ tốt nhất là từ 50-120oC [8, 25, 26].
Sơ đồ 1.6. Phản ứng ngưng tụ tạo các dẫn chất bis 2-mercaptobenzimidazol.
21
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, thiết bị
Thực hiện luận văn này chúng tôi đã sử dụng một số hóa chất, dung môi và thiết bị của phòng thí nghiệm Tổng hợp hóa dược- Bộ môn Công nghiệp Dược, bao gồm:
2.1.1. Hóa chất
Các hóa chất và dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm đã được thống kê trong bảng 2.1 sau:
Bảng 2.1.Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm.
TT Tên hóa chất, dung môi Xuất xứ
1 O-Phenylendiamin Merck, Đức 2 Acid acetic Merck, Đức 3 Dicloromethan Trung Quốc 4 Aceton Trung Quốc 5 Acetonitril Trung Quốc 6 Cloroform Trung Quốc 7 Tetrahydrofuran Trung Quốc 8 Methanol Trung Quốc 9 Ethanol tuyệt đối Trung Quốc 10 Kali carbonat Trung Quốc 11 N,N-dimethylformamid (DMF) Trung Quốc 12 Acid sulfuric đặc Trung Quốc 13 Acid bromhydric Trung Quốc
22
14 Natri hydroxyd Trung Quốc 15 Natri sulfat Trung Quốc 16 Kali hydroxyd Trung Quốc 17 Carbon disulfid Trung Quốc 18 Nước cất Việt Nam
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ
Các máy móc, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm được thống kê trong bảng 2.2 sau:
Bảng 2.2. Các máy móc, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm.
T
T Tên máy móc, dụng cụ Xuất xứ
1 Sinh hàn hồi lưu Đức
2 Bình cầu 25ml, 50ml, 100ml, 250ml,
500ml Đức
3 Bình cầu 2 cổ 100ml Đức
4 Nhiệt kế thủy ngân Trung Quốc 5 Bộ lọc hút chân không Buchner Trung Quốc 6 Máy khuấy từ gia nhiệt IKA Đức
7 Máy cất quay Buchi B480 Thụy sỹ 8 Cân kỹ thuật Sartorius BP 2001S Thụy sỹ 9 Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt Mỹ 10 Tủ sấy Memmert Đức 11 Bản mỏng silicagel GF254 Merck Đức (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
23
12 Pipet 0,5ml, 1ml, 5ml, 10ml Đức
13 Ống đong 20ml, 25ml, 100ml Trung Quốc 14 Bình chiết 50ml, 100ml, 250ml Trung Quốc 15 Bình sắc ký Trung Quốc 16 Đĩa petri Trung Quốc 17 Cốc có mỏ 50ml, 100ml, 250ml Trung Quốc 18 Đèn tử ngoại (soi bản mỏng) Đức
19 Tủ lạnh Hàn Quốc 20 Bếp bọc (Heating Mantles) Hàn Quốc 21 Máy đo phổ hồng ngoại GX-Perkin Elmer Mỹ
22 Máy đo phổ khối lượng Agilent 6310 Ion Trap và Autospec Premier Mỹ
23 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AV-500 Mỹ
2.2. Nội dung nghiên cứu
1. Tổng hợp một số dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol.
- Sử dụng phản ứng alkyl hóa với các tác nhân benzyl clorid, ECA, MCA tạo nhóm thế mới ở vị trí S, N1 trên khung 2-mercaptobenzimidazol.
- Thực hiện phản ứng ngưng tụ tạo hợp chất bis-2-mercaptobenzimidazol. 2. Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được.
3. Thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống ung thư của một số dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol tổng hợp được.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Tổng hợp hóa học 2.3.1. Tổng hợp hóa học
24
- Sử dụng các phương pháp thực nghiệm cơ bản trong hóa học hữu cơ để tổng hợp các chất dự kiến.
- Dùng SKLM để theo dõi tiến triển của phản ứng. Soi đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm để nhận biết vết sắc ký.
- Xác định độ tinh khiết của các sản phẩm tổng hợp được bằng phương pháp SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy.
2.3.2. Xác định cấu trúc
Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được dựa trên kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR), Phổ khối lượng phân tử (MS), Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H – NMR).
Phổ hồng ngoại (IR):
Được ghi tại phòng Phân tích hữu cơ - Viện hóa học Việt Nam, trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-400cm-1. Mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1:200 rồi ép dưới dạng viên nén dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm.
Dải hấp thụ nằm trong vùng 1640-1590 cm-1 đặc trưng cho liên kết C=N; vùng 1512-1403 cm-1 đặc trưng cho liên kết C=C và vùng 1371-1257 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-N.
Dải hấp thụ trong vùng 3179-3136 cm-1 đặc trưng cho liên kết N-H.
Dải hấp thụ trong vùng 1750-1738 cm-1 đặc trưng cho liên kết C=O, vùng 1220-1179 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-O.
Phổ khối lượng phân tử (MS):
Được ghi theo chế độ không phân mảnh (ESI) trên máy Autospec Premier tại khoa Hóa Trường Đại học Khoa học tự nhiên - Hà Nội và trên máy Agilent 6310 Ion Trap tại phòng Phân tích hữa cơ - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam. Phổ cộng hưởng từ
25
Được ghi trên máy Bruker AV-500 tại phòng Phân tích phổ - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.
Độ dịch chuyển hóa học của proton vòng thơm của các chất dao động trong khoảng 7,09-7,65 ppm
Độ dịch chuyển hóa học của proton nhóm CH2 trong liên kết -CH2-S- dao động trong khoảng 3,33-3,62 ppm.
Độ dịch chuyển hóa học của proton nhóm CH2 trong liên kết -CH2-N- dao động trong khoảng 4,04-5,35 ppm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.3. Thử tác dụng sinh học
Thử tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn:
Thử tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm tiến hành theo phương pháp khuếch tán trên thạch, thực hiện tại bộ môn Vi sinh- Sinh học của Trường Đại học Dược Hà Nội
2.3.3.1. Nguyên tắc
Thử tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm được tiến hành theo phương pháp khuếch tán trên thạch. Mẫu thử (có chứa hoạt chất thử) được đặt lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy vi sinh vật kiểm định, hoạt chất từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn hoặc vòng vô nấm.
2.3.3.2. Cách tiến hành
a. Các vi sinh vật sử dụng trong thử nghiệm
Bộ môn Vi sinh - Sinh học, Trường Đại học Dược Hà Nội tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn với 5 vi khuẩn Gram (+) và 5 vi khuẩn Gram (-), thử tác dụng kháng nấm với 4 vi nấm:
+ Vi khuẩn Gram (-) gồm:
- Escherichiacoli ATCC 25922 (EC)
- Proteusmirabilis BV 108 (Pro)
26
- Salmonellatyphi DT 220 (Sal)
- Pseudomonas aeruginosa VM 201 (Pseu)
+ Vi khuẩn Gram (+) gồm:
- Staphylococcusaureus ATCC 1128 (Sta)
- Bacilluspumilus ATCC 10241 (Bp)
- Bacillussubtilis ATCC 6633 (Bs)
- Bacillus cereus ATCC 9946 (Bc)
- SarcinaluteaATCC 9341 (SL)
+ Vi nấm kiểm định gồm:
- Candida albicans (Ca)
- Aspergillus niger (As)
- Saccaromyces ceravitiae (Sa)
- Penicilium sp. (Pe)
Kháng sinh đối chiếu: Streptomycin (Strep) 14µg/ml và Penicillin (Peni) 27 UI/ml đối với thử nghiệm kháng khuẩn và Itraconazol (Itra) 50µg/ml đối với thử nghiệm kháng nấm.
b. Môi trường thử nghiệm
Bảng 2.3.Các môi trường trong thử nghiệm kháng khuẩn và kháng nấm.
Kháng khuẩn Kháng nấm Canh thang nuôi cấy VK Thạch thường Sabouraud lỏng nuôi cấy C. albicans Thử nghiệm Sabouraud - NaCl 0,5% - Cao thịt 0,3% - Pepton 0,5% - Nước vừa - NaCl 0,5% - Thạch 1,6% - Pepton 0,5% - Nước vừa - Pepton 1,0% -Glucose 2,0% - Nước vừa đủ 100ml. - Pepton 1,0% - Glucose 2,0% - Thạch 1,6%
27 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
đủ 100ml. đủ 100ml. - Nước vừa đủ 100ml.
+ Đánh giá kết quả: Dựa trên đường kính vòng vô khuẩn hoặc vòng vô nấm và được đánh giá theo công thức:
2 1 1 ( ) 1 n n i i i i D D D D s n n
D: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn hoặc vòng vô nấm, Di: Đường kính vòng vô khuẩn hoặc vòng vô nấm thứ i,
s : Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh, n : số thí nghiệm làm song song (n=3).
Thử tác dụng kháng tế bào ung thư:
Theo phương pháp của Skehan & cộng sự ( 1990 ) và Likhiwitayawuid & cộng sự ( 1993) hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư quốc gia của Mỹ (NCI) và Trường Đại học Dược, đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ, thực hiện tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên- phòng Sinh học thực nghiệm.
Dòng tế bào thử: Dòng Hep-G2: Ung thư gan và dòng MCF7: ung thư biểu mô vú.
Môi trường nuôi cấy tế bào: DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)
hoặc MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt). Có bổ sung L- glutamine, Sodium piruvat, NaHCO3, PSF(Penixillin- Streptomycin sulfate- Fungizone); NAA (Non-Essential Amino Acids); 10% BCS (Bovine Calf Serum).Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfoside); TCA(Trichloro Acetic acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamine B); Acid Acetic.
28
pipet pasteur, các đầu tuýp cho micropipet…
Chất chuẩn chứng dương tính: Dùng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào: Ellipithine, Vinblastine hoặc Taxol pha trong DMSO.
Đọc trên máy ELISA ở bước sóng 495-515nm
Tính kết quả: Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử tính theo % so với đối chứng. Dựa trên kết quả đo được của chúng OD (ngày 0), DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS(%) theo công thức:
OD (mẫu) – OD (ngày 0)
CS% = x 100 OD (DMSO) – OD (ngày 0)
Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên, đựơc đưa vào tính toán Excel để tìm ra % trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn của phép thử được lặp lại 3 lần theo công thức của Ducan như sau: Độ lệch tiêu chuẩn
(xi - x )2 =
n-1
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS < 50%) sẽ được chọn ra để thử nghiệm tiếp để tìm giá trị IC50
Giá trị IC50 : dùng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chương trình Table curve theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng
độ chất thử để tính giá trị IC50.(Mẫu tinh có IC50 ≤ 10µg là có hoạt tính) Công thức: 1/y=a+blnX
Trong đó Y: nồng độ chất thử; X: Giá trị CS (%)
29
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. Tổng hợp hóa học
Thông qua các tài liệu tham khảo và dựa vào điều kiện của phòng thí nghiệm, các hóa chất cho phép, chúng tôi đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất của 2- mercaptobenzimidazol đi từ nguồn nguyên liệu ban đầu là o-phenylendiamin theo sơ đồ sau:
30 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
31
3.1.1. Tổng hợp 2-mercaptobenzimidazol (chất II)
Phương pháp của Van Allan và Deacon :
Sơ đồ 3.2:Sơ đồ tổng hợp 2-mercaptobenzimidazol [25].
Tiến hành: Cho vào bình cầu hỗn hợp gồm có: 7,03g (65 mmol) O-
phenylendiamin và 3,64g (65 mmol) KOH, 70ml ethanol, 12ml nước cất, sau đó thêm từ từ 3,93ml (65 mmol) carbon disulfid (CS2) và thêm vài viên đá bọt (để làm hỗn hợp phản ứng sôi đều). Tiến hành hồi lưu trong 3 giờ. Theo dõi tiến triển phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi là dicloromethan: methanol (20: 1) và hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm.
Xử lý hỗn hợp phản ứng: Sau khi phản ứng kết thúc, thêm vào hỗn hợp phản ứng 0,7g than hoạt, tiếp tục đun trong vòng 10 phút, sau đó lọc nóng và rửa 3 lần bằng ethanol (bỏ than hoạt và đá bọt). Dịch thu được thêm 70ml nước nóng (60-70oC), acid hóa đến pH khoảng 5-6, tiếp tục khuấy khoảng 1 giờ. Lọc lấy tủa (rửa bằng nước cất) và sấy khô dưới đèn hồng ngoại, thu được sản phẩm thô. Tinh chế bằng cách kết tinh lại trong EtOH 50%, thu được 9,15g sản phẩm.
Kết quả: - Cảm quan: sản phẩm là tinh thể hình phiến mỏng, màu trắng bạc
- Nhiệt độ nóng chảy tonc 302-3060C [25]
- Hiệu suất phản ứng 93,89%, Rf (CH2Cl2: CH3OH=20:1)=0,32. 3.1.2. Tổng hợp các dẫn chất của 2-mercaptobenzimidazol.
3.1.2. 3.1.2.1. Tổng hợp 2-benzylthio-1H-benzo[d]imidazol (chất III)
32
Sơ đồ 3.3: Tổng hợp 2-benzylthio-1H-benzo[d]imidazol
Tiến hành: Cho hỗn hợp gồm: 3 g (0,02 mol) 2-mercaptobenzimidazol (II); 2,9 g K2CO3 khan và 70 ml aceton vào trong bình cầu 2 cổ dung tích 100 ml, kết hợp khuấy từ. Thêm từ từ 2,3 ml (0,02 mol) benzylclorid vào hỗn hợp trên, khuấy ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Sau đó hồi lưu hỗn hợp trên trong 7 giờ. Theo dõi tiến triển phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 100:1, hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm.
Xử lý hỗn hợp sau phản ứng: Hỗn hợp sau khi kết thúc phản ứng được làm nguội đến nhiệt độ phòng rồi lọc loại bỏ muối vô cơ. Dịch lọc được thêm 40ml nước cất, khuấy kỹ, sẽ xuất hiện tủa màu trắng. Sau đó lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước cất (15ml x 3 lần), sấy tủa ở nhiệt độ 50-60°C, thu được 3,60g sản phẩm.
Kết quả: - Cảm quan: sản phẩm là bột màu trắng, xốp.
- Nhiệt độ nóng chảy: tonc 186-1870C.
- Hphản ứng =75%. Rf (CH2Cl2:CH3OH=100:1) =0,67.
3.1.2.2.Tổng hợp 1-benzyl-2-(benzylthio)-1H-benzo[d]imidazol (chất III-a).
Sơ đồ phản ứng:
Sơ đồ 3.4: Tổng hợp 1-benzyl-2-(benzylthio)-1H-benzo[d]imidazol
Tiến hành: Thêm 0,5 g (2 mmol) 2-benzylthio-1H-benzo[d]imidazol (III) và 0,5 g K2CO3 khan trong 10 ml DMF khan vào bình cầu 2 cổ dung tích 100 ml,
33
kết hợp khuấy từ. Thêm từ từ 0,14 ml (2 mmol) benzylclorid vào hỗn hợp trên. Khuấy ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Sau đó đun hỗn hợp trên ở nhiệt độ 110 Co trong 20 giờ. Theo dõi tiến triển phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 100:1, hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm.
Xử lý hỗn hợp sau phản ứng: Hỗn hợp sau khi kết thúc phản ứng được làm nguội đến nhiệt độ phòng rồi lọc loại bỏ muối vô cơ. Dịch lọc được thêm 30 ml nước cất và khuấy kỹ khoảng 4 giờ. Xuất hiện tủa màu trắng, lọc lấy tủa, rửa bằng nước cất (10 ml x 3 lần). Sấy tủa ở 50-60°C, thu được 0,62g sản phẩm.
Kết quả: - Cảm quan: sản phẩm là bột màu trắng, xốp.
- Nhiệt độ nóng chảy: tonc 80-900C.
- Hphản ứng =90,18%. Rf (CH2Cl2:CH3OH=100:1) =0,86.
3.1.2.3. Tổng hợp methyl 2-(2-(benzylthio)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)acetat ( chất III-b). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sơ đồ phản ứng
Sơ đồ 3.5: Tổng hợp methyl 2-(2-(benzylthio)-1H-benzo[d]imidazol-1- yl)acetat
Tiến hành: Cho vào bình cầu dung tích 50 ml hỗn hợp gồm: 0,5 g (2 mmol) 2-benzylthio-1H-benzo[d]imidazol (III), 0,5 g K2CO3 và 10 ml DMF khan, khuấy ở nhiệt độ phòng. Thêm từ từ 0,183 ml (2 mmol) methyl cloroacetat (MCA) vào hỗn hợp trên. Khuấy tiếp hỗn hợp trên ở nhiệt độ thường trong 1 giờ. Sau đó đun hỗn hợp trên ở nhiệt độ 105oC trong 5 giờ. Theo dõi tiến triển phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi dicloromethan:methanol=100:1, hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254
34
nm.
Xử lý hỗn hợp sau phản ứng: Hỗn hợp sau phản ứng được xử lý bằng