Các phƣơng pháp sinh học phân tử

2.3.3.1. Tách ADN

Máu tĩnh mạch của đối tƣợng nghiên cứu đƣợc chống đông bằng EDTA. ADN tổng số đƣợc tách từ tế bào bạch cầu sử dụng bộ Kit Wizard® Genomic ADN Purification (Promega Corporation, USA). Các bƣớc tiến hành nhƣ sau:

1. Thêm 900 μl dung dịch Cell Lysic Solution vào ống 1,5 ml đã tiệt trùng 2. Lắc nhẹ ống máu đến khi trộn hoàn toàn; chuyển 300 μl máu sang ống chứa

dung dịch Cell Lysic Solution. Đảo ống nhẹ nhàng 5 – 6 lần để trộn đều 3. Ủ dung dịch đã trộn 10 phút ở nhiệt độ phòng (đảo ống 2 – 3 lần khi ủ). Ly

tâm ở 14.000xg trong 20 giây ở nhiệt độ phòng

4. Loại bỏ tối đa dung dịch nổi nhƣng không chạm vào hạt trắng có thể nhìn thấy ở đáy ống. Để lại khoảng 20 μl dung dịch

5. Thêm 100 μl dung dịch Cell Lysis Solution, làm lại bƣớc 3 và 4. Để lại khoảng 20 μl dung dịch

39

6. Thêm 300 μl dung dịch Nuclei Lysis Solution 7. Vortex cho tới khi tan kết tủa

8. Ủ dung dịch ở 37o

C trong 30 phút cho tới khi kết tủa tan hoàn toàn 9. Làm mát ở nhiệt độ phòng (ít nhất 5 phút)

10. Thêm 1,5 μl dung dịch RNase Soulution vào và trộn mẫu bằng cách đảo đầu ống 2 – 5 lần

11. Ủ hỗn hợp ở 37o

C trong 15 phút. Làm mát ở nhiệt độ phòng ít nhất là 5 phút 12. Thêm 100 μl dung dịch Protein Precipitation (có thể thấy kết tủa protein) 13. Vortex mạnh trong 10 – 20 giây

14. Ly tâm ở 13.000 – 16.000 xg trong 3 phút ở nhiệt độ phòng (xuất hiện kết tủa màu nâu ở đáy ống )

15. Cho 300 μl isopropanol ở nhiệt độ phòng vào ống 1,5 ml vô trùng mới

16. Chuyển dung dịch nổi sau khi ly tâm ở bƣớc 14 vào ống chứa isopropanol. Chú ý không hút hết dung dịch và để đầu pipet chạm vào kết tủa protein tránh nhiễm ADN với kết tủa

17. Trộn nhẹ nhàng dung dịch bằng cách đảo đầu cho tới khi có thể nhìn thấy vẩn tủa là các sợi ADN màu trắng

18. Ly tâm ở 13.000 – 16.000 xg (có thể thấy hạt ADN vẩn tủa màu trắng) 19. Gạn bỏ dung dịch nổi, thấm dung dịch trên thành ống sau khi gạn

20. Thêm 300 μl cồn 70% ethanol ở nhiệt độ phòng, đảo nhẹ ống vài lần để rửa kết tủa ADN. Ly tâm 14.000 xg ở nhiệt độ phòng

21. Hút cẩn thận dung dịch ethanol bằng pipet (hoặc pipet Pasteur) 22. Đảo ống đặt trên giấy thấm và làm khô hạt tủa ở nhiệt độ phòng 23. Thêm 100 μl dung dịch ADN Rehydration Soulution vào ống 24. Ủ dung dịch qua đêm ở 4 o

C(hoặc ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng; hoặc ủ dung dịch ở 65 độ C trong 1 giờ, phải trộn dung dịch bằng cách búng nhẹ vào ống) 25. Bảo quản ADN ở âm 20oC.

Dung dịch chứa ADN đƣợc đo nồng độ và đánh giá độ tinh sạch bằng máy NanoDrop.

40

2.3.3.2. Xác định kiểu gen bằng phương pháp ASP-PCR

Nguyên lý phƣơng pháp ASP: Phƣơng pháp ASP đƣợc tiến hành trên hai phản ứng PCR song song riêng biệt, mỗi phản ứng sử dụng một cặp mồi đặc hiệu tại đầu 3’ để nhận biết một alen [16].

Cặp mồi sử dụng:

Mồi xuôi F: 5’-ggctcttgaatgaaatagga-3’

Mồi ngƣợc phát hiện alen A: Ra:5’–agactatccaagtgcatcaga–3’ Mồi ngƣợc phát hiện alen T: Rt: 5’–agactatccaagtgcatcagt–3’

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR như sau:

Sản phẩm sau phản ứng PCR đƣợc điện di ở 100v trong 30 phút trên thạch Agarose 2,5%, sử dụng đệm TBE 0,5X. Băng sản phẩm đƣợc nhuộm RedSafe và chụp bằng máy GelDoc (Hình 3.1).

Xác định kiểu gen của đối tượng dựa trên kết quả điện di:

Có ba trƣờng hợp xảy ra: đồng hợp tử AA, dị hợp tử AT và đồng hợp tử TT.

 Trƣờng hợp 1: PCR 1 (+); PCR 2 (-): Kiểu gen là AA (Ví dụ: số 20 trên băng điện di).

 Trƣờng hợp 2: PCR 1 (-); PCR 2 (+): Kiểu gen là TT (Ví dụ: số 1,2, 4-10, 12, 13, 16, 18, 19, 21 trên băng điện di).

 Trƣờng hợp 3: PCR 1(+); PCR (2) (+): Kiểu gen là AT (Ví dụ: số 3, 11, 14, 15, 17, 22 trên băng diện di).

41

2.3.3.3. Xác định kiểu gen bằng phương pháp RFLP-PCR

Kiểm tra ngẫu nhiên 10% số mẫu bằng phƣơng pháp RFLP–PCR để kiểm tra sự chính xác của phƣơng pháp ASP [16].

Phƣơng pháp PRFP–PCRlà phƣơng pháp nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân đoạn ADN dựa trên điểm cắt của các enzyme giới hạn (Restriction Enzyme, RE). Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt giới hạn đối với vị trí nhận biết của chúng trên ADN bộ gen. Khi ủ với enzyme giới hạn ở dung dịch đệm, pH, nhiệt độ và thời gian thích hợp, đoạn ADN sẽ bị enzyme giới hạn cắt ở vị trí đặc hiệu để tạo ra những phân đoạn ADN với kích thƣớc khác nhau. Dựa vào kích thƣớc các đoạn sau khi cắt để xác định alen và kiểu gen.

Trong nghiên cứu này chúng tôi thiết kế phƣơng pháp RFLP–PCR gồm 4 bƣớc sau:

Bước 1. Dùng phản ứng nhân gen (PCR) để khuếch đại đoạn gen chứa SNP.

 Enzyme cắt giới hạn: FastDigest®ScaI (Fermentas) Vị trí nhận biết của ScaI:

5'... A G T↓A C T...3' 3'....T C A↑T G A...5'

 Cặp mồi đƣợc sử dụng:

 Mồi xuôi F: 5’ggctcttgaatgaaatagga3’

 Mồi ngƣợc R: 5’agagactatccaagtgcagtac3’

 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:

Điện di 5 µl sản phẩm trên thạch agarose 2,5 %, đệm TBE 0.5x trong 30 phút ở 100v, nhuộm RedSafe và chụp hình để kiểm tra kết quả.

42

Bước 2. Ủ sản phẩm PCR với enzyme đặc hiệu.

Những mẫu có băng 170 bp rõ nét đƣợc ủ enzyme giới hạn FastDigest ScaI trong 15 phút với các thành phần gồm: 5 µl sản phẩm PCR, 0,8 µl 10x FastDigest, 0,2 µl enzyme FastDigest®ScaI, và 4 µl nƣớc tinh sạch. Điện di 10 µl sản phẩm sau khi ủ trên thạch agarose 2,5%, đệm TBE 0,5x trong 40 phút ở 100v, nhuộm RedSafe và chụp hình sản phẩm điện di sau khi ủ enzym cắt giới hạn (Hình 3.2).

Bước 3. Nhận định kiểu gen từ sản phẩm

 Kiểu gen TT: băng 170 bp ( mẫu số 1-5, 7, 11, 12 và 16)

 Kiểu gen AA: băng 150 bp và 20 bp (mẫu số 14)

 Kiểu gen AT: băng 170 bp, 150 bp và 20 bp (mẫu số 6 – 8 và 13)

Băng sản phẩm 20 bp không xuất hiện do kích thƣớc nhỏ đã chạy ra khỏi bản thạch trong quá trình điện di.

So sánh kết quả xác định các kiểu gen bằng phƣơng pháp RFLP-PCR ở 10% mẫu với kết quả xác định SNP bằng phƣơng pháp AS-PCR cho thấy: Tất cả các mẫu đều cho kết quả tƣơng đồng ở cả hai phƣơng pháp.