Sau khi tham khảo các tài liệu, dựa vào điều kiện phòng thí nghiệm và các hóa chất cho phép, đề tài đã tiến hành tổng hơp l//-benzimidazol và dẫn chất theo sơ đồ sau:
'NH, HCOOH H HNO3/H2SO4 H O0N' 'N II r \ N CICH2COOC2H5 r:'N III Hình 2: Sơ đồ tổng hợp một sổ dẫn chất benzimidazol thực ngỉệm 3.1.1. Tổng hợp lH-benzimidazol(I) a. Tổng hợp
17í-Benzimidazol được tổng hợp theo phương pháp 1 của John B. Wright, từ o-phenylendiamin và acid formic.
24
Phương trĩnh phản ứng như sau:
+
'NH.
HCOOH- + 2H2O
Tiến hành phản ứng: Cho vào bình cầu 2 cổ 100 ml 5,4 gam (0,05 mol) o- Phenylendiamin và 2,85 ml acid formic (0,075 mol, d = l,2196g/ml), thêm đá bọt và đun hồi lưu 2h ở 100 °c. Sau đó chuyển từ từ khối phản ứng này vào cốc có mỏ 250 ml chứa khoảng lOOml nước lạnh, đồng thời làm lạnh bên ngoài cốc, khuấy, thêm từ từ NaOH 10% để điều chỉnh pH về 8. Lọc lấy tủa, rửa với nước lạnh 2 lần, đem sấy dưới đèn hồng ngoại thu được sản phẩm thô.
Tinh chế sản phẩm: Hòa sản phẩm thô trong nước đun cách thủy cho hòa tan hoàn toàn, làm lạnh để kết tinh l//-benzimidazol, lọc lấy phần kết tinh, rửa qua bằng nước lạnh, đem sấy dưới đèn hồng ngoại.
Sản phẩm thu được là tinh thể l//-benzimidazol có màu vàng nâu. b. Kiểm ừ'a độ tinh khiết của sản phẩm thu được
Chúng tôi đã kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất l//-benzimidazol vừa tổng hơp được bằng SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy như sau:
SKLM được tiến hành trên bản nhôm tráng sẵn silicagel Merck 70- 230 mesh, quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm.
Dung môi hòa tan: Ethanol 96”.
25
Kết quả thu được trên sắc ký đồ thấy một vết rõ, gọn, không có vết phụ khi soi dưới ánh sáng tử ngoại.
Hệ số lưu giữ Rf = 0,4
Đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ- Melt: Nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm tổng hợp được là: 174- 176 °c.
Nhận xét: Với hệ dung môi khai triển chất tổng hợp được cho vết gọn rõ và nhiệt độ nóng chảy của chất này có khoảng dao động hẹp. Như vậy, có thể kết luận sơ bộ chất tổng hợp được là tinh khiết.
c. Khảo sát tỉ lệ mol acid formic : o-phenylendỉamỉn dùng trong phản ứng
Tiến hành phản ứng như trên với 1,08 g 0-phenylendiamin (0,01 mol) và lượng acid formic như trong bảng, hồi lưu hỗn hợp chất phản ứng trong 2 giờ, xử lý sản phẩm. Hiệu suất của nhiều mẻ phản ứng được ghi trong bảng 2.
Bảng 2: Khảo sát tỉ lệ mol acỉd formic : o-phenylendiamin dùng trong phản ứng. Lượng acid forniic(iiil) Lượng o- phenylendỉamin (gam) Tỉ lê mol• Hiệu suất (%) 0,19 1,08 1 :2 12,91 0,38 1,08 1 : 1 41,34 2,85 5,4 1,5 : 1 87,80 0,76 1,08 2 : 1 88,13
26
Từ kết quả bảng 2, chúng tôi chọn tỉ lệ mol acid formic : o- phenylendiamin là 1,5 : 1 để khảo sát yếu tố khác.
d. Khảo sát về thời gian phản ứng
Tiến hành phản ứng như phần a mục 3.1.1 với 5,4 gam 0-phenylendiamin, và 2,85 ml acid formic (tức sử dụng tỉ lệ mol acid formic : 0-phenylendiamin là 1,5 : 1), trong đó thời gian giữ hỗn hợp phản ứng trước khi xử lý sản phẩm là 0,5 giờ; 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ.
Hiệu suất của các phản ứng được ghi trong bảng 3.
Bảng 3: Khảo sát thời gian phản ứng
Khoảng thời gian khảo sát (giờ) Hiêu suất sản phẩm (%) 0,5 21,39 1 43,12 2 87,80 4 90,32
Như vậy dựa vào kết quả ở bảng 3 có thể chọn thời gian giữ nguyên khối phản ứng trước khi xử lý sản phẩm là 2 giờ để thu được hiệu suất cao đồng thời tiết kiệm được thời gian.
3.1.2. Tổng hợp 5-nitro-lH-benzimidazol (II)
a. Tổng hợp
5-nitro-17i/-benzimidazol được tổng hợp theo phương pháp như M. c.
Sharma và cộng sự đã mô tả, theo đó họp chất I được nitro hóa bằng hỗn hợp sulfonitric( tỉ lệ thể tích HNO3: H2SO4 là 1 : 1).
27
Phương trình phản ứng:
+ HNO3 H2SO4
O2N
+ H2O
Tiến hành phản ứng: Cho 5,8 ml acid nitric đặc vào bình cầu 3 cổ đã được lắp trên giá đỡ, có con khuấy từ và làm lạnh bên ngoài bằng đá, thêm từ từ 5,8 ml acid sulfiiric vào, bật máy khuấy từ để trộn đều hỗn hợp. Sau đó thêm từ từ 1,2 gam chất I vào hỗn hợp trên ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Sau khi khuấy liên tục trong 14 giờ, hỗn họp phản ứng được rót vào cốc có mỏ 100 ml có chứa đá vụn sạch, khuấy kĩ cho tủa hoàn toàn. Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước lạnh, sấy tủa dưới đèn hồng ngoại thu được sản phẩm thô.
Tinh chế sản phẩm: Hòa tan toàn bộ sản phẩm thô thu được ở trên trong ethanol 50°, đun nóng bằng đèn cồn cho hòa tan hoàn toàn, để kết tinh từ từ ở nhiệt độ phòng. Lọc lấy tinh thể, rửa bằng nước lạnh, sấy dưới đèn hồng ngoại.
Sản phẩm thu được là tinh thể 5-nitrobenzimidazol có màu vàng nhạt. Hiệu suất phản ứng: H = 91%.
b. Kiểm tra độ tỉnh khiết của sản phẩm thu được
Tiến hành kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm thu được;
- SKLM được tiến hành trên bản nhôm tráng sẵn silicagel Merck 70- 230 mesh, quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm.
Dung môi hòa tan: Ethanol
28
Ket quả thu được trên sắc ký đồ đối với hệ dung môi triển khai thấy một vết rõ, gọn, không có vết phụ khi soi dưới ánh sáng đèn tử ngoại (xem phụ lục
15).
Hệ số lưu giữ Rf = 0,375 với hệ dung môi khai triển là cloroform ; methanol (9 : 1).
Hệ số lưu giữ Rf = 0,55 với hệ dung môi khai triển là ethylacetat : n-hexan (7 ; 3).
- Đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt Nhiệt độ nóng chảy của II là: 224 - 226°c.
Nhận xét:
Với hệ dung môi triển khai chất tổng hợp cho vết gọn rõ trên bản sắc ký và nhiệt độ nóng chảy của chất này có khoảng dao động hẹp.
Như vậy, có thể kết luận sơ bộ chất tổng hợp được là tinh khiết.
3.1.3. Tổng hợp ethyl (IH-benzimidazol-l-yl)acetat (III)
a. Tông hợp lân 1
Ethyl (l//-benzimidazol-l-yl)acetat được tổng hợp theo phương pháp như K. F. Ansari, c. Lal đã mô tả vào năm 2009.
Phương trình phản ứng: CH2COOC2H5 'N ^ + HCl y + CICH2C00C2H5 (I) Tiến hành phản ứng: ( I I I )
29
Lắp bình cầu 2 cổ có chứa con khuấy từ với sinh hàn, đậy nắp sinh hàn bằng dụng cụ có chứa CaO làm khan để đảm bảo phản ứng xảy ra trong điều kiện khan hoàn toàn. Cho 1,18 gam (0,01 mol) hợp chất I tổng họp ở trên vào bình cầu. Thêm 20 ml methanol vào, bật máy khuấy từ, thêm 0,5 ml NaOH 4N, tiếp đó thêm 1 ml (0,01 mol) ethylcloracetat vào hỗn hợp phản ứng. Hỗn hợp phản ứng được khuấy liên tục và đun nóng nhẹ trong nồi cách thủy trong 2 giờ. Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi Cloroform : MeOH (9 : 1).
Xử lỷ dịch sản phẩm sau phản ứng:
Kết thúc phản ứng, chấm sắc ký dịch sau phản ứng trên bản nhôm tráng sẵn silicagel Merck 70-230 mesh, dung môi triển khai là hệ Cloroform: MeOH (9 : 1), quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm.
Kết quả thu được trên sắc ký đồ đối với hệ dung môi triển khai thấy có 2 vết rõ, gọn, trong đó 1 vết là vết nguyên liệu ban đầu, và 1 vết lạ.
Rfl = 0,4; Ro = 0,57
Như vậy sản phẩm thu được có lẫn nguyên liệu ban đầu. Do đó, chúng tôi sử dụng sắc ký cột để tách lấy sản phẩm.
Chuyển toàn bộ khối phản ứng vào bình cầu một cổ và cất quay hết dung môi methanol, thu được sản phẩm. Hòa tan sản phẩm này trong một lượng tối thiểu dung môi triển khai sắc ký đem chạy sắc ký cột.
Dung môi triển khai; Cloroform : MeOH ( 9: 1)
Chuẩn bị cột sắc ký: Tráng cột bằng methanol, để khô cột, cho 1 miếng bông ở đáy cột, sau đó nhồi cột bằng silicagel đã được làm trương nở bằng hệ dung môi triển khai. Dùng 1 miếng giấy lọc đặt lên mặt trên của lớp silicagel.
30
Tiến hành chạy sắc ký: Dùng pipet sạch, khô hút dịch sản phẩm đã được hòa tan trong dung môi triển khai sắc ký ở trên nhỏ từ từ lên cột. Mở khóa cột cho dịch chảy nhỏ giọt. Khi lóp dịch sản phẩm chạy đến gần sát miếng giấy lọc trên bề mặt lớp silicagel, cho 1 miếng bông nhỏ lên phía trên lớp dịch sản phẩm, và đổ dung môi chạy sắc ký. Theo dõi quá trình tách thấy vết sản phẩm chạy trước, tiến hành thu sản phẩm.
Thu sản phẩm được tiến hành như sau: Chuẩn bị một dãy các ống nghiệm, đánh số thứ tự. Khi vết sản phẩm chạy gần sát miếng bông ở đáy cột, thu lấy dịch vào các ống nghiệm, bắt đầu từ ống nghiệm số 1. Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm thu được bằng SKLM. SKLM được tiến hành trên bản nhôm tráng sẵn silicagel Merck 70-230 mesh, quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm. Dung môi triển khai là hệ Cloro form : MeOH (9 : 1).
Kết quả thu được trên sắc ký đồ với hệ dung môi triển khai cho thấy - Dịch thu được ở ống nghiệm 1, 2, 3, 4 cho 1 vết rõ, gọn.
- Bắt đầu từ ống nghiệm 5 dịch thu được có 2 vết, trong đó có vết nguyên liệu ban đầu.
Như vậy, thu lấy các ống nghiệm 1, 2, 3, 4, gộp vào bình cầu 1 cổ đem cất quay hết dung môi, thu được sản phẩm III tinh khiết màu vàng.
b. Tổng hợp lần 2:
Tiến hành phản ứng tương tự như lần 1, nhưng thực hiện trong dung môi aceton khan (20 ml), xúc tác là K2CO3 khan (1 gam), và hồi lưu trong 10
giờ.
Các bước xử lý dịch sản phẩm sau phản ứng tương tự như lần 1, và thu được sản phẩm III tinh khiết có màu vàng.
31
3.1.4. Xác định cẩu trúc của các hợp chất tồng hợp được
Để xác định cấu trúc hóa học của chất tổng hợp được, đề tài đã tiến hành đo phổ hồng ngoại của các hợp chất I, II, III và phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ’H-NMR của các họp chất II, III tại Viện hóa học Việt Nam.
a. Phổ hồng ngoại
Phổ hồng ngoại của 3 chất I, II, III được trình bày ở phụ lục 1-3. Số liệu phân tích hồng ngoại của hợp chất I được trình bày ở bảng 4:
Bảng 4: sổ liệu phân tích phổ hồng ngoại của chất I
Vmax (cm'^) Nhóm
1683 ; 1587 -C=C- vòng thơm
3067 >C-H nhân thơm
Số liệu phân tích hồng ngoại của họp chất II được trình bày ở bảng 5:
Bảng 5: sổ liệu phân tích phổ hồng ngoại của chất II
Dmax (cm‘^) Nhóm
1619 ; 1540 -CH-CH- vòng thơm
3097 >C-H nhân thoTn
1434 -NO2
828 >C-NƠ2
32
r 9 \ r
Bảng 6: Sô liệu phân tích phô hông ngoại •của hợp chât III
Vmax (cm'^) Nhóm 1618 ; 1500 -C=C- vòng thơm 3107 >C-H nhân thơm 1376 -C-CH3 1749 -c=0 1213 c -o -c 2993 ; 2944 -CH2-
b. Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 'H-NMR được ghi bằng máy Bruker AV-500MHz, dùng MeOD làm dung môi.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của hợp chất (II) và (III) được trình bày trong phụ lục 4, 5. Kết quả biện giải phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton được trình bày trong bảng 7 và bảng 8:
Bảng 7: Ket quả phân tích phổ ^H-NMR của benzimỉdazol
Công thức l/r-benzimidazoI E[ợp chất (II)
ô (ppm) Vi trí
7,27 2H, dd, C^H, C^H 7,61 2H, dd, C^H, C^H
33
Bảng 8: Kết quả phân tích phổ ^H-NMR của
ethyỉ (IH-benzimidazol-l-yl)acetat
Công thức ethyl (lH-benzimidazol-l- yl)acetat Hợp chất (III) 1' 2' 3' CH2COOCH2CH3 4 ô (ppm) Vi trí 1,22 3H, t, C^’H3 4,17 2H, q, Ơ H2 5,07 2H, s, N-C’’H2 7.28 2H, m, C^H, C^H 7,41 IH, dd, 7,69 IH, dd, C^H 8,12 IH, s, C^H
3.1.5. Thử khả năng gây độc tế bào của các hợp chất tổng hợp được
a. Nguyên tắc:
Thử nghiệm hoạt tính kháng các tế bào ung thư được tiến hành tại Phòng thử tác dụng sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Đây là phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa kỳ (NCI) công nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro.
b. Dòng tế bào thử nghiệm:
Các chất II, III được thử độc tính tế bào trên dòng tế bào KB( Human epidemic carcinoma), ung thư biểu mô, là dòng luôn luôn được sử dụng trong các phép thử độ độc tế bào
34
Dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37°C; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đổi. xế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính.
c. Tiến hành:
Sử dụng 200 |il dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 X 1 o'* tế bào/ml ở mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trưòng RPMI 1640 cho dòng tế bào KB, mẫu thử được xử lý với tế bào ở các nồng độ pha loãng khác nhau sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng là 128 ịig/ml; 32 ]ig/ml; 8 )ig/ml; 2 )Lig/ml; 0,5 I^g/ml. ủ 37°c, 5% CO2 3 ngày, giếng điều khiển gồm 200 )al dung dịch tế bào 3 X
1 0"^ tế bào/ml, ủ 37°c, 5% CO2 3 ngày, thêm 50 Ịil MTT (1 mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh), ủ 37°c 4 giờ, loại bỏ môi trường, thêm 100 |il DMSO lắc đều.
d. Đọc kết quả:
Đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN. Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào (Growth inlibition) = (OD điều khiển - OD mẫu) / OD điều khiển. Giá trị IC5 0 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve.
Kết quả thử tác dụng chống ung thư (thử độ độc tế bào) của các chất tổng hợp được II, III được trình bày ở bảng 9:
35
r r
Bảng 9: Kêt quả thử hoạt tính độc tê bào
STT Tên mẫu
Kết quả: Giá trị IC50 (fig/ml) của mẫu thử trên dòng tế bào
KB
1 Ethyl( l//-benzimidazol-1 -yl)acetat >128
2 5-nitro- li/-benzimidazol >128
Chất tham khảo
Ellipticin 0,62-1,25
Kết quả trong bảng cho thấy các chất tổng hợp được không có tác dụng chống ung thư.
3.2. Bàn luân
3.2.1. Giai đoạn tồng hợp lH-benzimỉdazol
Phản ứng tổng hợp benzimidazol là phản ứng xảy ra dễ dàng, không cần sự có mặt của acid HCl làm xúc tác,và cho hiệu suất tương đối cao. Tuy nhiên, để đạt được hiệu suất tối ưu cần lưu ý một số điểm sau;
- về tỉ lệ mol giữa các chất tham gia phản ứng (acid formic và o- phenylendiamin):
+ Khi sử dụng tỉ lệ mol giữa acid formic và 0-phenylendiamin là 1; 2 thì hiệu suất là 12,91%.
36
+ Khi tỉ lệ mol giữa acid formic và o-phenylendiamin là 1:1 thì hiệu suất là 41,34%. Đây chính là tỉ lệ mol theo lý thuyết phản ứng.
+ Khi dùng tỉ lệ mol giữa acid formic và o-phenylendiamin là 1,5 : 1
thì hiệu suất là 87,80% . Như vậy khi dùng với lượng thừa acid formic thì quá trình tổng hợp cho hiệu suất tốt hơn.
+ Tiếp tục tăng tỉ lệ mol giữa acid formic và 0-phenylendiamin là 2 : 1 thì hiệu suất là 88,13 «i 87,80% (tăng không đáng kể).
Do đó, để thu được hiệu suất tối ưu nên dùng tỉ lệ mol giữa acid formic và o-phenylendiamin là 1,5 : 1.
- về thời gian phản ứng:
+ Khi giữ khối phản ứng 0,5 giờ trước khi xử lý thì hiệu suất đạt 21,39%.
+ Khi giữ khối phản ứng 1 giờ trước khi xử lý thì hiệu suất tăng tử