a. Tông hợp lân 1
Ethyl (l//-benzimidazol-l-yl)acetat được tổng hợp theo phương pháp như K. F. Ansari, c. Lal đã mô tả vào năm 2009.
Phương trình phản ứng: CH2COOC2H5 'N ^ + HCl y + CICH2C00C2H5 (I) Tiến hành phản ứng: ( I I I )
29
Lắp bình cầu 2 cổ có chứa con khuấy từ với sinh hàn, đậy nắp sinh hàn bằng dụng cụ có chứa CaO làm khan để đảm bảo phản ứng xảy ra trong điều kiện khan hoàn toàn. Cho 1,18 gam (0,01 mol) hợp chất I tổng họp ở trên vào bình cầu. Thêm 20 ml methanol vào, bật máy khuấy từ, thêm 0,5 ml NaOH 4N, tiếp đó thêm 1 ml (0,01 mol) ethylcloracetat vào hỗn hợp phản ứng. Hỗn hợp phản ứng được khuấy liên tục và đun nóng nhẹ trong nồi cách thủy trong 2 giờ. Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi Cloroform : MeOH (9 : 1).
Xử lỷ dịch sản phẩm sau phản ứng:
Kết thúc phản ứng, chấm sắc ký dịch sau phản ứng trên bản nhôm tráng sẵn silicagel Merck 70-230 mesh, dung môi triển khai là hệ Cloroform: MeOH (9 : 1), quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm.
Kết quả thu được trên sắc ký đồ đối với hệ dung môi triển khai thấy có 2 vết rõ, gọn, trong đó 1 vết là vết nguyên liệu ban đầu, và 1 vết lạ.
Rfl = 0,4; Ro = 0,57
Như vậy sản phẩm thu được có lẫn nguyên liệu ban đầu. Do đó, chúng tôi sử dụng sắc ký cột để tách lấy sản phẩm.
Chuyển toàn bộ khối phản ứng vào bình cầu một cổ và cất quay hết dung môi methanol, thu được sản phẩm. Hòa tan sản phẩm này trong một lượng tối thiểu dung môi triển khai sắc ký đem chạy sắc ký cột.
Dung môi triển khai; Cloroform : MeOH ( 9: 1)
Chuẩn bị cột sắc ký: Tráng cột bằng methanol, để khô cột, cho 1 miếng bông ở đáy cột, sau đó nhồi cột bằng silicagel đã được làm trương nở bằng hệ dung môi triển khai. Dùng 1 miếng giấy lọc đặt lên mặt trên của lớp silicagel.
30
Tiến hành chạy sắc ký: Dùng pipet sạch, khô hút dịch sản phẩm đã được hòa tan trong dung môi triển khai sắc ký ở trên nhỏ từ từ lên cột. Mở khóa cột cho dịch chảy nhỏ giọt. Khi lóp dịch sản phẩm chạy đến gần sát miếng giấy lọc trên bề mặt lớp silicagel, cho 1 miếng bông nhỏ lên phía trên lớp dịch sản phẩm, và đổ dung môi chạy sắc ký. Theo dõi quá trình tách thấy vết sản phẩm chạy trước, tiến hành thu sản phẩm.
Thu sản phẩm được tiến hành như sau: Chuẩn bị một dãy các ống nghiệm, đánh số thứ tự. Khi vết sản phẩm chạy gần sát miếng bông ở đáy cột, thu lấy dịch vào các ống nghiệm, bắt đầu từ ống nghiệm số 1. Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm thu được bằng SKLM. SKLM được tiến hành trên bản nhôm tráng sẵn silicagel Merck 70-230 mesh, quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm. Dung môi triển khai là hệ Cloro form : MeOH (9 : 1).
Kết quả thu được trên sắc ký đồ với hệ dung môi triển khai cho thấy - Dịch thu được ở ống nghiệm 1, 2, 3, 4 cho 1 vết rõ, gọn.
- Bắt đầu từ ống nghiệm 5 dịch thu được có 2 vết, trong đó có vết nguyên liệu ban đầu.
Như vậy, thu lấy các ống nghiệm 1, 2, 3, 4, gộp vào bình cầu 1 cổ đem cất quay hết dung môi, thu được sản phẩm III tinh khiết màu vàng.
b. Tổng hợp lần 2:
Tiến hành phản ứng tương tự như lần 1, nhưng thực hiện trong dung môi aceton khan (20 ml), xúc tác là K2CO3 khan (1 gam), và hồi lưu trong 10
giờ.
Các bước xử lý dịch sản phẩm sau phản ứng tương tự như lần 1, và thu được sản phẩm III tinh khiết có màu vàng.
31
3.1.4. Xác định cẩu trúc của các hợp chất tồng hợp được
Để xác định cấu trúc hóa học của chất tổng hợp được, đề tài đã tiến hành đo phổ hồng ngoại của các hợp chất I, II, III và phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ’H-NMR của các họp chất II, III tại Viện hóa học Việt Nam.
a. Phổ hồng ngoại
Phổ hồng ngoại của 3 chất I, II, III được trình bày ở phụ lục 1-3. Số liệu phân tích hồng ngoại của hợp chất I được trình bày ở bảng 4:
Bảng 4: sổ liệu phân tích phổ hồng ngoại của chất I
Vmax (cm'^) Nhóm
1683 ; 1587 -C=C- vòng thơm
3067 >C-H nhân thơm
Số liệu phân tích hồng ngoại của họp chất II được trình bày ở bảng 5:
Bảng 5: sổ liệu phân tích phổ hồng ngoại của chất II
Dmax (cm‘^) Nhóm
1619 ; 1540 -CH-CH- vòng thơm
3097 >C-H nhân thoTn
1434 -NO2
828 >C-NƠ2
32
r 9 \ r
Bảng 6: Sô liệu phân tích phô hông ngoại •của hợp chât III
Vmax (cm'^) Nhóm 1618 ; 1500 -C=C- vòng thơm 3107 >C-H nhân thơm 1376 -C-CH3 1749 -c=0 1213 c -o -c 2993 ; 2944 -CH2-
b. Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 'H-NMR được ghi bằng máy Bruker AV-500MHz, dùng MeOD làm dung môi.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của hợp chất (II) và (III) được trình bày trong phụ lục 4, 5. Kết quả biện giải phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton được trình bày trong bảng 7 và bảng 8:
Bảng 7: Ket quả phân tích phổ ^H-NMR của benzimỉdazol
Công thức l/r-benzimidazoI E[ợp chất (II)
ô (ppm) Vi trí
7,27 2H, dd, C^H, C^H 7,61 2H, dd, C^H, C^H
33
Bảng 8: Kết quả phân tích phổ ^H-NMR của
ethyỉ (IH-benzimidazol-l-yl)acetat
Công thức ethyl (lH-benzimidazol-l- yl)acetat Hợp chất (III) 1' 2' 3' CH2COOCH2CH3 4 ô (ppm) Vi trí 1,22 3H, t, C^’H3 4,17 2H, q, Ơ H2 5,07 2H, s, N-C’’H2 7.28 2H, m, C^H, C^H 7,41 IH, dd, 7,69 IH, dd, C^H 8,12 IH, s, C^H
3.1.5. Thử khả năng gây độc tế bào của các hợp chất tổng hợp được
a. Nguyên tắc:
Thử nghiệm hoạt tính kháng các tế bào ung thư được tiến hành tại Phòng thử tác dụng sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Đây là phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa kỳ (NCI) công nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro.
b. Dòng tế bào thử nghiệm:
Các chất II, III được thử độc tính tế bào trên dòng tế bào KB( Human epidemic carcinoma), ung thư biểu mô, là dòng luôn luôn được sử dụng trong các phép thử độ độc tế bào
34
Dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37°C; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đổi. xế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính.
c. Tiến hành:
Sử dụng 200 |il dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 X 1 o'* tế bào/ml ở mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trưòng RPMI 1640 cho dòng tế bào KB, mẫu thử được xử lý với tế bào ở các nồng độ pha loãng khác nhau sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng là 128 ịig/ml; 32 ]ig/ml; 8 )ig/ml; 2 )Lig/ml; 0,5 I^g/ml. ủ 37°c, 5% CO2 3 ngày, giếng điều khiển gồm 200 )al dung dịch tế bào 3 X
1 0"^ tế bào/ml, ủ 37°c, 5% CO2 3 ngày, thêm 50 Ịil MTT (1 mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh), ủ 37°c 4 giờ, loại bỏ môi trường, thêm 100 |il DMSO lắc đều.
d. Đọc kết quả:
Đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN. Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào (Growth inlibition) = (OD điều khiển - OD mẫu) / OD điều khiển. Giá trị IC5 0 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve.
Kết quả thử tác dụng chống ung thư (thử độ độc tế bào) của các chất tổng hợp được II, III được trình bày ở bảng 9:
35
r r
Bảng 9: Kêt quả thử hoạt tính độc tê bào
STT Tên mẫu
Kết quả: Giá trị IC50 (fig/ml) của mẫu thử trên dòng tế bào
KB
1 Ethyl( l//-benzimidazol-1 -yl)acetat >128
2 5-nitro- li/-benzimidazol >128
Chất tham khảo
Ellipticin 0,62-1,25
Kết quả trong bảng cho thấy các chất tổng hợp được không có tác dụng chống ung thư.
3.2. Bàn luân
3.2.1. Giai đoạn tồng hợp lH-benzimỉdazol
Phản ứng tổng hợp benzimidazol là phản ứng xảy ra dễ dàng, không cần sự có mặt của acid HCl làm xúc tác,và cho hiệu suất tương đối cao. Tuy nhiên, để đạt được hiệu suất tối ưu cần lưu ý một số điểm sau;
- về tỉ lệ mol giữa các chất tham gia phản ứng (acid formic và o- phenylendiamin):
+ Khi sử dụng tỉ lệ mol giữa acid formic và 0-phenylendiamin là 1; 2 thì hiệu suất là 12,91%.
36
+ Khi tỉ lệ mol giữa acid formic và o-phenylendiamin là 1:1 thì hiệu suất là 41,34%. Đây chính là tỉ lệ mol theo lý thuyết phản ứng.
+ Khi dùng tỉ lệ mol giữa acid formic và o-phenylendiamin là 1,5 : 1
thì hiệu suất là 87,80% . Như vậy khi dùng với lượng thừa acid formic thì quá trình tổng hợp cho hiệu suất tốt hơn.
+ Tiếp tục tăng tỉ lệ mol giữa acid formic và 0-phenylendiamin là 2 : 1 thì hiệu suất là 88,13 «i 87,80% (tăng không đáng kể).
Do đó, để thu được hiệu suất tối ưu nên dùng tỉ lệ mol giữa acid formic và o-phenylendiamin là 1,5 : 1.
- về thời gian phản ứng:
+ Khi giữ khối phản ứng 0,5 giờ trước khi xử lý thì hiệu suất đạt 21,39%.
+ Khi giữ khối phản ứng 1 giờ trước khi xử lý thì hiệu suất tăng tử 21,39% lên 43,12%.
+ Khi giữ khối phản ứng 2 giờ trước khi xử lý thì hiệu suất đạt 87,80%. Như vậy khi tăng thời gian phản ứng thì quá trình tổng hợp cho hiệu suất tốt hõn.
+Tuy nhiên khi tiếp tục tăng thời gian phản ứng lên 4 giờ thì hiệu suất phản ứng đạt 90,32% (hiệu suất tăng không đáng kể).
Như vậy có thể chọn thời gian phản ứng trước khi xử lý sản phẩm là 2 giờ để thu được hiệu suất cao đồng thời tiết kiệm thời gian.
- Benzimidazol ít tan trong nước lạnh, nhưng lại tan tốt trong nước nóng. Do đó khi kết tinh lại thu sản phẩm tinh khiết cần đun nóng cách thủy rồi để nguội, sau đó cho vào tủ lạnh để sản phẩm dễ kết tinh thu hiệu suất cao.
37
3.2.2. Giai đoạn tồng hợp 5-nừrobenziỉnìdazol
Phản ứng nitro hóa xảy ra dễ dàng và cho hiệu suất cao. Nguyên nhân là do hỗn hợp sulíonitric là tác nhân nitro hóa mạnh.
Trong quá trình xử lý sản phẩm thô, do sản phẩm không kết tinh trong cồn tuyệt đối, cũng không kết tinh trong nước, nên cần tiến hành kết tinh trong ethanol 50°.
3.2.3. Giai đoạn tổng hợp Ethyl (lH-benzimidazol-l-yl)acetat
Phản ứng tổng hợp Ethyl (l//-benzimidazol-l-yl)acetat xảy ra không hoàn toàn, dịch sản phẩm thu được còn lẫn nguyên liệu ban đầu, do đó khó khăn cho việc tinh chế sản phẩm. Nguyên nhân phản ứng xảy ra chưa hoàn toàn có thể do;
- Phản ứng đòi hỏi thực hiện trong môi trưòng khan hoàn toàn, điều kiện phòng thí nghiệm cũng như hóa chất sử dụng có thể chưa đáp ứng được (tổng hợp lần 2).
- Đối với phương pháp tổng hợp lần 1, tức sử dụng dung môi là methanol và xúc tác là NaOH 4N, và không đòi hỏi thực hiện trong môi trường khan, do đó tác nhân thế ethyl cloroacetat có thể bị thủy phân trong quá trình phản ứng.
3.2.4. về phổ hồng ngoại:
Các chất I, II, III đều có:
+ Dải hấp thụ trong khoảng 3107- 3067 đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết C-H của nhân thơm.
+ Dải hấp thụ trong khoảng 1683- 1500 đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết c = c của nhân thơm.
38
Mặt khác:
+ Phổ hồng ngoại của họp chất II có thêm nhóm NO2 đã xuất hiện trên phổ đồ, sơ bộ chứng minh chất tổng họp được II là hợp chất 5-nitrobenzimidazol. + Phổ hồng ngoại của họp chất III có thêm nhóm -C=0 và C-O-C ester; -C- CH3 và nhóm -CH2- sơ bộ chứng minh chất tổng hợp được III là hợp chất Ethyl ( l/í-benzimidazol-1 -yl)acetat.
3.2.5. về phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Phổ chất I: xuất hiện 5H C-H của vòng benzimidazol nhưng H của NH không xuất hiện.Có thể giải thích như sau: trong dung môi MeOD, OD có khả năng trao đổi với NH nên không thu được tín hiệu H của NH trên phổ đồ.
Phổ chất III: xuất hiện 5H C-H của vòng benzimidazol, 5H của nhóm CH2CH3 và 2H của cầu nối methylen -CH2- với vòng benzimidazol
Như vậy dựa vào phổ đồ của các chất có thể khẳng định H của N-H trong hợp chất I đã bị thế bởi nhóm -CH2COOCH2CH3 tạo thành hợp chất III.
3.2.6. về tác dụng sinh học
Các hợp chất đã được thử tác dụng sinh học trên dòng tế bào KB nhưng không có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào này, do đó cả 2 hợp chất II và III đều không có tác dụng chống ung thư.
39
KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ
Kết luận:
Như vậy, đề tài tiến hành nghiên cứu tổng hợp một số dẫn chất benzimidazol hướng tác dụng chống ung thư từ nguyên liệu là o- phenylendiamin đã thu được các kết quả như sau:
1. Đã tổng họp được một số dẫn chất benzimidazol là: - Hợp chất I: l//-benzimidazol
- Hợp chất II: 5-nitro-benzimidazol
- Hợp chất III: Ethyl l//-benzimidazol-l-ylacetat 2. Đã chứng minh được các công thức tổng hợp trên.
3. Đã tiến hành thử khả năng gây độc tế bào của hợp chất II, III và kết luận 2 hợp chất này không có tác dụng chống ung thư trên dòng tế bào KB.
Kiến nghị:
1. Tiếp tục nghiên cứu tổng họp các dẫn chất benzimidazol với các nhóm thế khác nhau gắn trên bộ khung benzimidazol.
2. Thử tác dụng chống ung thư của các chất tổng hợp được để tìm ra chất mới có hoạt tính cao, có thể ứng dụng trên lâm sàng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Trần Mạnh Bình, Nguyễn Quang Đạt (2005), “Hóa học hữu cơ”, tậpl, Thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội, tr. 99-111 , 191-200, 127, 317. 2. Trần Mạnh Bình (2003), “Phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ ”,
Thư viện TrưÒTig Đại học Dược Hà Nội.
3. Bộ môn ung thư Tmôfng Đại học Y Hà Nội (2002), “Bài giảng ung thư
/2ọc”,NXB Y học,tr. 20-96.
4. Bộ môn ung thư Trường Đại học Y Hà Nội (2002), “Bài giảng ung thư
/2ọc”,NXB Y học,tr. 20-96.
5. Bộ Y tế - Bệnh viện K (2008), “tình hình bệnh ung thư trong khu vực và trên thế giới”, http://www.benhvienk.com
6. Bộ Y tế - Bệnh viện K Hà Nội (2005), “tìm hiểu bệnh ung thư”,
http://ungthu.net.
7. Bộ Y tế (2007), “Dược lý học ”, tập2, NXB Y học, tr. 242-253.
8. Bộ y tế (2010), “Con người đã chiến đấu với bệnh ung thư như thế nào”,
Sức khỏe và đời sổng, (chủ nhật số 50), tr. 14.
9. Bộ y tế (2010), “Con người đã chiến đấu với bệnh ung thư như thế nào”,
Sức khỏe và đời sống, (chủ nhật số 50), tr. 14.
10.Nguyễn Bá Đức (2003), “Hóa chất điều trị bệnh ung thư”, NXB Y học, tr. 1-55.
11 .Nguyễn Bá Đức (2003), “Hóa chất điều trị bệnh ung thư”, NXB Y học, tr. 1-55.
12.Nguyễn Bá Đức (2006), “Những kiến thức cơ bản về phòng chống ung
//2w” NXB Hà Nội, tr. 37-52.
13.Nguyễn Đình Triệu (1995), “Các phương pháp vật lý ứng dụng trong
14.Nguyễn Đình Triệu (2001), “Các phương pháp phân tích vật lý và hóa ỉý ”, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr. 54-105, 195-228.
15.A. Selcen Alpa (2007), “Ilỉ-benzimidazoỉ derivatives as mammalian DNA topoỉsomerase I inhibitors ”
16. Shardia A. Galal (2010), “Synthesis and antitumor activity of novel benzimidazole-5-carboxylic acid derivatives and thei transition metal complexes as topoisomerase II inhibitors”, European Joural of