* Nguyên tắc
Thử sàng lọc hoạt tính kháng nấm được tiến hành theo phương pháp của Vander Berger và Vlietlinck [48], thực hiện trên các phiến vi lượng 96 giếng, theo 2 bước sau đây:
- Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính.
- Bước 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính.
• Kháng sinh đối chiếu
Nystatin hoặc Amphotericin B đối với nấm mốc và nấm men.
• Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm Nấm mốc: Aspergilus niger (493)
Fusarium oxysporum (M42) Nấm men: Candida albicans (ATCC 7754)
Sacharomyces cerevisiae (SH 20)
• Các bước tiến hành:
Bước 1:Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính. + Chuẩn bị vi sinh vật:
Vi nấm được nuôi dưỡng trong môi trường dinh dưỡng Sabouraud dextrose broth và Trypease soya broth (TBS).
+ Chuẩn bị mẫu thử:
Các chất thử được hòa tan trong dung môi DMSO nguyên chất với nồng độ 4mg/ml.
Từ dung dịch gốc pha loãng thành 4-10 thang nồng độ rồi nhỏ sang phiến vi lượng 96 giếng.
Nhỏ vào mỗi giếng đã có sẵn dung dịch VSV đã được hoạt hóa và được pha loãng bằng môi trường dinh dưỡng cho tới nồng độ tương đương 0,5 đơn vị McLand (khoảng 108
VSV/ml). + Chuẩn bị mẫu đối chứng dương: Dãy 1: Môi trường.
Dãy 2: Kháng sinh Nystatin + vi khuẩn kiểm định. + Chuẩn bị mẫu đối chứng âm:
Chỉ có VSV kiểm định, không có kháng sinh hay chất thử. + Đọc kết quả:
Kết quả đọc sau khi ủ các phiến thí nghiệm trong tủ ấm 370C/24 giờ cho vi khuẩn và 300/ 48 giờ đối với nấm mốc và nấm men. Kết quả dương tính là ở nồng độ mà khi nhìn bằng mắt thường thấy trong suốt không thấy có vi sinh vật kiểm định phát triển giống như hình ảnh ở các chứng giếng dương. Khi nuôi cấy lại nồng độ này trên môi trường thạch đĩa để kiểm tra, có giá trị CFU < 5.
Mức dương ở bước 1 sẽ được tiếp tục thử ở bước 2 để tính giá trị MIC.
Bước 2:Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các chất có hoạt tính.
Các mẫu đã có hoạt tính được sàng lọc ở bước 1 được pha loãng theo các nồng độ thấp dần từ 5 – 10 thang nồng độ để tính giá trị tối thiểu mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn.
CHƯƠNG 3
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. TỔNG HỢP HÓA HỌC
• Sơ đồ tổng hợp hóa học
Trong khóa luận này, chúng tôi đã tiến hành các phản ứng tổng hợp theo sơ đồ phản ứng sau đây:
HCOOH + NH2NH2 .H2O N N N H2N t0 Ar CHO HCl , t0 N N N N HC Ar Trong đó: Chất Ar Chất Ar Chất Ar Chất Ar II Cl IV Cl VI OH VIII III F V NO2 VII NO 2 3.1.1. Tổng hợp 4-amino-4H-1,2,4-triazol.(I)
4-Amino-4H-1,2,4-triazol là chất trung gian để tổng hợp các hợp chất azomethin trong công trình này. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát phản ứng tổng hợp 4-Amino-4H-1,2,4-triazol theo các phương pháp của E.C. Horning [26] và M.V. Rubtsov; A.G. Baichikov [42].
3.1.1.1.Tổng hợp 4-amino-4H-1,2,4-triazol theo phương pháp E.C. Horning
• Giai đoạn 1: Tổng hợp formyl hydrazin (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phương trình phản ứng
HCOOC2H5 + NH2NH2 .H2O 18h HCONHNH2 + C2H5OH + H2O t0
- Dụng cụ: bình cầu đáy tròn dung tích 250ml, sinh hàn, nhiệt kế, máy khuấy từ gia nhiệt, máy cất quay chân không.
- Tiến hành: cho 25ml EtOH vào bình cầu tiếp theo cho 25ml ethyl formiat 97% (0,3mol) và 21ml (0,36mol) dung dịch hydrazine hydrat 85%, lắp sinh hàn, đun sôi cách thủy duy trì trong 18h, để nguội ở nhiệt độ phòng, cất loại dung môi.
• Giai đoạn 2: tổng hợp 4-amino-4H-1,2,4-triazol
Phương trình phản ứng: 2 HCONHNH2 N N N H2N t0 3h
- Dụng cụ: bình cầu đáy tròn dung tích 250ml, sinh hàn hồi lưu, nhiệt kế, máy khuấy từ gia nhiệt.
- Tiến hành:
cho toàn bộ lượng sản phẩm formyl hydrazine ở giai đoạn 1 vào bình cầu đun cách cát, duy trì nhiệt độ hỗn hợp phản ứng 150-2000C trong vòng 3h. Đổ sản phẩm ra cốc, làm lạnh bằng nước đá, lọc hút qua phễu Buchner.
Kết tinh lại: hòa tan hoàn toàn sản phẩm thô trong 15ml EtOH 95% nóng, lọc nóng, thêm 15ml ether và làm lạnh. Sản phẩm kết tinh lại, lọc hút qua phễu Buchner, làm khô bằng bình hút ẩm, thu được 6,9g sản phẩm kết tinh, tinh thể màu trắng .
• Kết quả: - Hiệu suất: 55%
- Nhiêt độ nóng chảy: 70-71o
C
- Sản phẩm là bột kết tinh màu trắng, rất dễ hút ẩm trong không khí và chuyển thành màu hồng.
- Sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi CHCl3: EtOH (6:1), thu được một vết gọn, rõ khi soi dưới ánh đèn tử ngoại, Rf= 0,47
●Kết luận:
- Đã tổng hợp được chất Itheo phương pháp của E.C. Horning [26], phản ứng cho hiệu suất là: 55%.
- Kết quả sắc kí lớp mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy cho thấy sản phẩm thu được tinh khiết và có nhiệt độ nóng chảy trùng với các số liệu đã công bố trong các tài liệu tham khảo được [26].
3.1.1.2.Tổng hợp 4-amino-4H-1,2,4-triazol theo phương pháp M.V .Rubtsov; A.G. Baichikov
Phương trình phản ứng: 2 HCOOH + 2 NH2NH2 .H2O N N N H2N + 6 H2O 150-2000C 4h PTL: 84.08 C2H4N4
- Dụng cụ: bình cầu đáy tròn dung tích 250ml, sinh hàn ngang, nhiệt kế, bình hứng, máy khuấy từ gia nhiệt.
- Tiến hành:
Cho vào bình cầu 30ml (0,6mol) acid formic 85%, làm lạnh bằng nước đá đến 50C. Thêm từ từ 71.4ml (0,72mol) hydrazin hydrat 50%, phản ứng tỏa nhiệt mãnh liệt. Lắp sinh hàn, đun cách cát, nâng từ từ nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng lên đến 150-2000
C và duy trì ở nhiệt này trong 4h, nước từ hỗn hợp phản ứng được đều đặn cất ra. Đổ sản phẩm ra cốc, làm lạnh bằng nước đá, sản phẩm kết tinh hoàn toàn, lọc hút qua phễu Buchner.
Kết tinh lại: hòa tan hoàn toàn sản phẩm thô trong 25ml EtOH 95% nóng, lọc nóng, thêm 25ml ether. Làm lạnh sản phẩm kết tinh lại, lọc hút qua phễu Buchner.
Hút kiệt dung môi: làm khô bằng bình hút ẩm, thu được 19,5g sản phẩm kết tinh tinh thể màu trắng.
(I) (II-VIII)
•Kết quả :
- Hiệu suất: 77,3%
- Nhiệt độ nóng chảy: 70-71o (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
C.
- Sản phẩm là bột kết tinh màu trắng, rất dễ hút ẩm trong không khí chuyển thành màu hồng.
- Sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi triển khai là CHCl3: EtOH (6:1) thu một vết gọn, rõ khi soi dưới ánh đèn tử ngoại, Rf = 0,47
•Kết luận:
- Đã tổng hợp được chất I theo phương pháp của M.V. Rubtsov; A.G. Baichikov với hiệu suất là: 77,3%.
- Kết quả sắc kí lớp mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy cho thấy sản phẩm thu được tinh khiết và có nhiệt độ nóng chảy trùng với các số liệu đã công bố trong các tài liệu tham khảo được [26], [42] .
3.1.2. Tổng hợp các azomethin của 4-amino-4H-1,2,4-triazol.
Các dẫn chất của dị vòng triazol có ý nghĩa quan trọng và đã được nhiều tác giả nghiên cứu. Trong công trình này chúng tôi đã tổng hợp thêm một số dẫn chất azomethin của 4-amino-4H-1,2,4-triazol với các aldehyd thơm, phản ứng xảy ra trong dung môi EtOH, ở nhiệt độ đun sôi cách thủy, sử dụng xúc tác acid HCl. Về mặt lí thuyết, việc sử dụng xúc tác acid là hợp lý vì 4-amino- 4H-1,2,4-triazol là một base yếu nên cần dùng acid mạnh để proton hóa carbon của nhóm carbonyl(C=O) làm tăng khả năng cộng hợp ái nhân của nhóm carbonyl do đó sẽ tăng khả năng phản ứng ngưng tụ.
Xuất phát từ 4-amino-4H-1,2,4-triazol (I) tổng hợp được và các aldehyd thơm, chúng tôi tiến hành tổng hợp một số azomethin theo phương trình tổng quát sau: N N N H2N Ar CHO HCl , t0 N N N N HC Ar + EtOH
Sau đây là kết quả thực nghiệm tổng hợp hóa học của các chất trong công trình này. 3.1.2.1. Tổng hợp 4- (2’-clorobenzyliden )-amino-4H-1,2,4-triazol(II) Công thức N N N N HC Cl PTL: 206.64 CTPT: C9H7ClN4
Dụng cụ: Bình cầu 3 cổ 100ml, sinh hàn hồi lưu, máy khuấy từ gia nhiệt. Tiến hành:
Cho vào bình cầu 3 cổ: 0,84g chất I (0,01mol) đã hòa tan trong 5ml EtOH và 1,40g 2-clorobenzaldehyd (0,01mol) đã hòa tan trong 10ml EtOH, thêm 2-3 giọt acid HCl làm xúc tác, lắp sinh hàn, đun hồi lưu cách thủy, theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển là CHCl3:MeOH (12:1), xác định được thời gian phản ứng thích hợp là 45 phút, sau đó đổ sản phẩm ra cốc, làm lạnh để kết tinh hoàn toàn, lọc hút qua phễu Buchner, rửa tủa bằng EtOH lạnh. Kết tinh lại trong EtOH, sấy khô ở nhiệt độ 600C, thu được 1,11g sản phẩm.
Kết quả:
- Hiệu suất: 53,72%
- Nhiệt độ nóng chảy: 187-188o
C
Sản phẩm là bột kết tinh màu trắng hơi vàng, xốp nhẹ.
Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng sắc SKLM, hệ dung môi khai triển là CHCl3: MeOH (12:1), sản phẩm có Rf =0,38.
3.1.2.2. Tổng hợp 4-(4’-fluorobenzyliden )-amino-4H-1,2,4-triazol (III)
Công thức N N N N HC PTL:190.18 CTPT: C9H7FN4 F
Tiến hành:
Cho vào bình cầu 3 cổ: 0,84g chất I (0,01mol) đã hòa tan trong 5ml EtOH và 1,24g 4-fluorobenzaldehyd (0,01mol) đã hòa tan trong 10ml EtOH, thêm 2-3 giọt acid HCl, làm xúc tác, lắp sinh hàn, đun hồi lưu cách thủy, theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển là CHCl3: MeOH (12:1), xác định thời gian phản ứng thích hợp là 45 phút, sau đó đổ sản phẩm ra cốc, làm lạnh để kết tinh hoàn toàn, lọc hút qua phễu Buchner, rửa tủa bằng EtOH lạnh. Kết tinh lại trong EtOH, sấy khô ở nhiệt độ 600C, thu được 1,17g sản phẩm. Kết quả: - Hiệu suất: 61,32% - Nhiệt độ nóng chảy: 189-190o C Sản phẩm là bột kết tinh màu trắng, xốp nhẹ.
Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng sắc SKLM, hệ dung môi khai triển là CHCl3: MeOH (12:1), sản phẩm có Rf =0,67 3.1.2.3. Tổng hợp 4- (4’-clorobenzyliden)-amino-4H-1,2,4-triazol (IV) Công thức N N N N HC PTL: 206.64 CTPT: C9H7ClN4 Cl
Dụng cụ: Bình cầu 3 cổ 100ml, sinh hàn hồi lưu, máy khuấy từ gia nhiệt. Tiến hành:
Cho vào bình cầu 3 cổ : 0,84g chất I (0,01mol) đã hòa tan trong 5ml EtOH và 1.40g 2-clorobenzaldehyd (0,01mol) đã hòa tan trong 10ml EtOH, thêm 2-3 giọt acid, HCl làm xúc, tác lắp sinh hàn, đun hồi lưu cách thủy, theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển là CHCl3: MeOH (12:1), xác định thời gian phản ứng thích hợp là 45 phút, sau đó đổ sản phẩm ra cốc, làm lạnh để kết tinh hoàn toàn, lọc hút qua phễu Buchner, rửa tủa bằng
EtOH lạnh. Kết tinh lại trong EtOH, sấy khô ở nhiệt độ 600C, thu được 1,15g sản phẩm. Kết quả: - Hiệu suất: 55,65% - Nhiệt độ nóng chảy: 190-191o C
Sản phẩm là bột kết tinh màu trắng hơi vàng, xốp nhẹ.
Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng sắc SKLM, hệ dung môi khai triển là CHCl3: MeOH (12:1), sản phẩm có Rf =0,60 3.1.2.4. Tổng hợp 4-(3’-nitrobenzyliden)-amino-4H-1,2,4-triazol(V) Công thức N N N N HC PTL: 217.19 CTPT: C9H7N5O2 O2N
Dụng cụ: Bình cầu 3 cổ 100ml, sinh hàn hồi lưu, máy khuấy từ gia nhiệt. Tiến hành:
Cho vào bình cầu 3 cổ: 0,84g chất I (0,01mol) đã hòa tan trong 5ml EtOH và 1,51g 3-nitrobenzaldehyd (0,01mol) đã hòa tan trong 10ml EtOH, thêm 2-3 giọt acid HCl làm xúc tác, lắp sinh hàn, đun hồi lưu cách thủy, theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển là CHCl3: MeOH (12:1), xác định thời gian phản ứng thích hợp là 30 phút, sau đó đổ sản phẩm ra cốc, làm lạnh để kết tinh hoàn toàn, lọc hút qua phễu Buchner, rửa tủa bằng EtOH lạnh. Kết tinh lại trong EtOH : DMF (2:1), sấy khô ở nhiệt độ 600 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
C, thu được 1.38g sản phẩm. Kết quả: - Hiệu suất: 63,54% - Nhiệt độ nóng chảy: 225-226o C Sản phẩm là bột kết tinh màu vàng nhạt, xốp nhẹ.
Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng sắc SKLM, hệ dung môi khai triển là CHCl3: MeOH (12:1), sản phẩm có Rf =0,51 3.1.2.5 Tổng hợp 4-(2’-hydroxybenzyliden)-amino-4H-1,2,4-triazol(VI) Công thức N N N N HC PTL: 188.19 CTPT: C9H8N4O OH
Dụng cụ: Bình cầu 3 cổ 100ml, sinh hàn hồi lưu, máy khuấy từ gia nhiệt. Tiến hành:
Cho vào bình cầu 3 cổ: 0,84g chất I (0,01mol) đã hòa tan trong 5ml EtOH và 1,22g aldehyd salicylic (0,01mol) đã hòa tan trong 10ml EtOH, thêm 2-3 giọt acid HCl làm xúc tác, lắp sinh hàn, đun hồi lưu cách thủy, theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển là CHCl3: MeOH (12:1), xác định thời gian phản ứng thích hợp là 1 giờ, sau đó đổ sản phẩm ra cốc, làm lạnh để kết tinh hoàn toàn, lọc hút qua phễu Buchner, rửa tủa bằng EtOH lạnh. Kết tinh lại trong EtOH, sấy khô ở nhiệt độ 600C, thu được 1,26g sản phẩm. Kết quả: - Hiệu suất: 66,95% - Nhiệt độ nóng chảy: 204-205o C Sản phẩm là bột kết tinh màu trắng, xốp nhẹ.
Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng sắc SKLM, hệ dung môi khai triển là CHCl3: MeOH (12:1), sản phẩm có Rf =0,53 3.1.2.6 Tổng hợp 4-(4’-nitro-benzyliden)-amino-4H-1,2,4-triazol(VII) Công thức N N N N HC PTL: 217.19 CTPT: C9H7N5O2 O2N
Tiến hành:
Cho vào bình cầu 3 cổ: 0,84g chất I (0,01mol) đã hòa tan trong 5ml EtOH và 1.51g 4-nitrobenzaldehyd (0,01mol) đã hòa tan trong 10ml EtOH, thêm 2-3 giọt acid HCl, làm xúc tác, lắp sinh hàn, đun hồi lưu cách thủy, theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển là CHCl3: MeOH (12:1), xác định thời gian phản ứng thích hợp là 30 phút, sau đó đổ sản phẩm ra cốc, làm lạnh để kết tinh hoàn toàn, lọc hút qua phễu Buchner, rửa tủa bằng EtOH lạnh. Kết tinh lại trong EtOH : DMF (1:1), sấy khô ở nhiệt độ 600
C, thu được 1,56g sản phẩm. Kết quả: - Hiệu suất: 71,82% - Nhiệt độ nóng chảy: 245-246o C Sản phẩm là bột kết tinh màu vàng nhạt, xốp nhẹ.
Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng sắc SKLM, hệ dung môi khai triển là CHCl3: MeOH (12:1), sản phẩm có Rf = 0,42
3.1.2.7.Tổng hợp 4-benzyliden amino-4H-1,2,4-triazol (VIII)
Công thức: N N N N HC PTL: 172.19 CTPT: C9H8N4
Dụng cụ: Bình cầu 3 cổ 100ml, sinh hàn hồi lưu, máy khuấy từ gia nhiệt. Tiến hành:
Cho vào bình cầu 3 cổ : 0,84g chất I (0,01mol) đã hòa tan trong 5ml EtOH và 1,06g benzaldehyd (0,01mol) đã hòa tan trong 10ml EtOH, thêm 2-3 giọt acid HCl làm xúc tác, lắp sinh hàn, đun hồi lưu cách thủy, theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển là CHCl3: MeOH (12:1), xác định thời gian phản ứng thích hợp là 1 giờ, sau đó đổ sản phẩm ra cốc, làm lạnh để kết tinh hoàn toàn, lọc hút qua phễu Buchner, rửa tủa bằng EtOH
lạnh. Kết tinh lại trong EtOH : DMF (1:1), sấy khô ở nhiệt độ 600C, thu được thu được 0,77g sản phẩm. Kết quả: - Hiệu suất : 44,41% - Nhiệt độ nóng chảy : 170-171o C Sản phẩm là bột kết tinh màu trắng, xốp nhẹ.
Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng sắc SKLM, hệ dung môi khai triển là CHCl3: MeOH (12:1), sản phẩm có Rf = 0,35.
Kết luận
Trong phần tổng hơp hóa học, chúng tôi đã tổng hợp thành công chất trung gian 4-amino-4H-1,2,4-triazol (I) khảo sát theo hai phương pháp của M.V .Rubtsov; A.G. Baichikov [42] và E.C. Horning [26] và 7 dẫn chất azomethin của chất này (II-VIII)
Đã tiến hành khảo sát thông số thời gian phản ứng bằng sắc SKLM để xác định thời gian phản ứng thích hợp.
Đã sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được bằng SKLM và tiến hành đo nhiệt độ nóng chảy.
Việc xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được bằng phổ hồng ngoại,