Nguyên vật liệu thí nghiệm:
• Mẫu thử: 4 mẫu, bao gồm:
II, III, IV, VII
• Tế bào: gồm 4 dòng tế bào
- Dòng tế bào Hep-G2 (tế bào ung thư gan) - Dòng tế bào Hela (tế bào ung thư tử cung) - Dòng tế bào A549 (tế bào ung thư phổi)
- Dòng tế bào OVCAR-8 (tế bào ung thư buồng trứng)
• Hóa chất:
- MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide), môi trường nuôi cấy DMEM, huyết thanh thai bò (fetal bovine serum) của hãng in vitrogen.
- Adriamycin của hãng Sigma. - DMSO của hãng sigma. - Và các hóa chất khác.
• Máy móc thiết bị: máy đọc ELISA của hãng Thermo Labsystems, kính hiển vi soi ngược, và các máy móc khác.
Phương pháp:
Nguyên tắc:
- Áp dụng phương pháp MTT được biên soạn bởi tác giả Mosmann (1983) để đánh giá độc tính trên tế bào [34]. Nguyên tắc của phương pháp như sau: MTT là thử nghiệm in vitro để đo sự tăng sinh và sống sót của tế bào. Tế bào được nuôi cấy trong một đĩa 96 giếng, đáy bằng. Hợp chất MTT 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid, có màu vàng được thêm vào mỗi giếng và tế bào được ủ ở 37o
C, 5% CO2. Màu vàng này bị biến đổi thành formazan tím trong ty thể của những tế bào sống. Khả năng hấp thụ của dung dịch có màu này có thể được định lượng bằng máy quang phổ kế ở bước sóng 540 – 600 nm. Sự biến đổi màu chỉ xảy ra khi enzyme reductase trong ty thể là hoạt động, và do đó sự chuyển đổi có thể liên quan trực tiếp đến số lượng tế bào sống sót. Chúng tôi sử dụng phương pháp này để nghiên cứu độc tính của thuốc đối với tế bào.
Cách tiến hành:
- Nuôi cấy tế bào: Các dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, đánh thức và duy trì trong môi trường DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) có bổ sung huyết thanh bê tươi 10%, dung dịch kháng sinh và kháng nấm 1% (penicillin 50,000 units/L và streptomycin 50 mg/L). Tế bào được nuôi cấy cho phát triển tới mức khoảng 70%, thay môi trường sạch, tế bào này được dùng làm thí nghiệm.
- Mẫu thí nghiệm: Hòa mẫu thí nghiệm vào dung dịch DMSO 100% sao cho nồng độ gốc của các mẫu là 2 mg/ml. Tiếp theo pha thuốc nghiên cứu thành thang nồng độ gồm 5 nồng độ 100, 50, 25, 12,5 và 6,25 μg/ml. Nồng độ của thuốc thử được dùng theo tiêu chuẩn sàng lọc thuốc chống ung thư có nguồn
gốc dược liệu của tác giả Teicher 1997 [15]. Adriamycin được sử dụng làm chứng dương và dung dịch DMSO 0,1% được sử dụng làm chứng âm.
- Quy trình nuôi cấy:
1. Pha loãng tế bào ở nồng độ khoảng 2X104 tế bào/ml môi trường nuôi cấy. Thêm vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng 180μl huyền dịch tế bào. Để 3 giếng trống chứa môi trường nuôi cấy làm chứng trắng (blank control).
2. Các tế bào được nuôi trong môi trường ở 37o
C và 5% CO2 cho phép tế bào gắn vào đáy mỗi giếng của đĩa nuôi cấy. Giữ tế bào trong 24 giờ để tế bào ổn định.
3. Sau 24 giờ nuôi cấy, thêm 20 μl thuốc thử và thuốc chuẩn ở các nồng độ khác nhau vào mỗi giếng. Mỗi nồng độ được lặp lại ở 2 giếng. Lắc nhẹ đĩa nuôi cấy để thuốc được tan hoàn toàn trong môi trường.
4. Ủ đĩa nuôi cấy từ 48 giờ (37o
C, 5% CO2)cho phép thuốc phát huy tác dụng. Quan sát tế bào hàng ngày bằng kính hiển vi.
5. Chuẩn bị dung dịch MTT nồng độ 5mg/ml.
6.Thêm 20 μl dung dịch MTT vào mỗi giếng của đĩa nuôi cấy. Lắc nhẹ cho MTT khuếch tán đều trong môi trường nuôi cấy.
7.Ủ 37oC trong 3 giờ để MTT được chuyển hóa.
8.Loại bỏ môi trường trong các giếng của đĩa nuôi cấy.
9.Hoàn trả formazan (sản phẩm chuyển hóa MTT) bằng 100 μl DMSO. Lắc kỹ để formazan có thể tan hoàn toàn.
10. Đọc mật độ quang ở bước sóng 540 nm. Mật độ quang sẽ phản ánh số lượng tế bào sống sót.
- % tế bào sống sau khi đã xử lý thuốc so với chứng trắng được tính theo công thức như sau:
% tế bào sống = [OD540 của tế bào được xử lý] / [OD540 của tế bào không được xử lý thuốc] x 100%
- Cách tính giá trị IC50: Giá trị IC50 được tính bằng phân tích hồi quy không tuyến tính của đường cong đáp ứng liều tương ứng, sử dụng phần mềm Exell.