Tại phòng phổ hồng ngoại-Viện Hóa học 8 chất (I-VIII) đã được ghi phổ hồng ngoại (IR) trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật làm viên nén KBr ghi trong vùng 4000-500 cm-1 phổ đồ được trình bày từ phụ lục (1-8). Kết quả phân tích số liệu phổ hồng ngoại ghi ở bảng 3.3. Các số liệu phân tích phổ
hồng ngoại của các chất phù hợp với số liệu của các tài liệu tham khảo đã công bố [9], [10], [44].
Bảng 3.3. Số liệu phổ IR của các chất tổng hợp được
Chất Phổ IR (KBr), (cm -1 ) νNH 2 νCarom- H νC=N νC=C; νC=N (benzen, dị vòng) Carom-X νC-Cl νC-F νNO2 νC-OH I 3482 1641, 1525, 1378 II 3098 1654 1587, 1498, 1435 1054 III 3093 1603 1502, 1297 1233 IV 3095 1657 1591, 1513, 1492 1053 V 3086 1614 1524, 1362, 1289 1524, 1362 VI 2986 1606 1516, 1459, 1377 3118 VII 3093 1595 1519, 1345, 1315 1519, 1345 VIII 3093 1685 1608, 1576, 1505
3.2.2.2 . Phân tich phổ khối lượng (MS)
Phổ khối lượng được ghi trên các máy Varian MS tại phòng Phân tích cấu trúc - Viện Hóa học (Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam).
Phổ đồ phổ khối lượng của 7 chất (II -VIII)được trình bày từ phụ lục 9- 15.Số liệu phổ được ghi tại bảng 3.4.
Bảng 3.4.Số liệu phổ khối lượng của các chất II-VIII
Chất Khối lượng
phân tử m/z Chất Khối lượng phân tử m/z
II 206.63 207[M+H]+ VI 188.19 189[M+H]+
III 190.18 191[M+H]+ VII 217.19 218[M+H]+
IV 206.63 207[M+H]+ VIII 172.19 173[M+H]+
3.2.2.3. Phân tích phổ cộng hưởng từ proton (1
H-NMR) và cộng hưởng từ hạt nhân (13
C-NMR)
Chất nguyên liệu trung gian và hai hợp chất azol mới đã được tiến hành phân tích phổ 1
H-NMR và 13C-NMR. Phổ cộng hưởng từ proton (1
H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (13C-NMR) được ghi trên máy Bruker - AV500 tại Phòng phân tích cấu trúc - Viện Hoá học (Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam). Các phổ đồ phổ cộng hưởng từ proton (1
H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (13
C-NMR)lần lượt được trình bày ở các phụ lục 16–18 và 19-21. Kết quả phân tích phổ (1
H- NMR) và(13C-NMR)được ghi ở bảng 3.5 và bảng 3.6.
Bảng 3.5 Số liệu phổ 1
H-NMR của các chất I, II, III
Chất CTCT Phổ 1 H-NMR I N N N NH2 3 5 1 H-NMR (D2O), δ (ppm) 8,32 (d, 2H J =2 Hz, H-3, H-5); 4,70 (s, 2H, -NH2) II H C N N N N Cl 1 2 4 5 3 1' 6' 5' 4' 3' 2' 1H-NMR (CDCl3), δ (ppm) 9,05 (s, 1H,-CH=N-); 8,69 (s, 2H H-3, H-5); 8,14 (d, 1H, J = 7,5 Hz, H-6’); 7,50-7,47 (m, 2H, H-3’, H-5’); 7,42-7,39 (m, 1H, H-4’) III H C N N N N1 2 4 5 3 1' 6' 5' 4' 3' 2' F 1H-NMR (CDCl3 và MeOD), δ (ppm) 8,70 (d, 2H, J =10 Hz, H-3, H-5); 7,83-7,80 (m, 2H H-2’, H-6,); 7,14-7,11 (m, 2H, H-3’,H-5’)
Bảng 3.6 Số liệu phổ 13C-NMR của các chất I, II, III
Chất CTCT Phổ 13C-NMR I N N N NH2 3 5 13 C-NMR (D2O); δ (ppm) 144,66 ( C-3, C-5) II H C N N N N Cl 1 2 4 5 3 1' 6' 5' 4' 3' 2' 13C-NMR (CDCl3); δ (ppm) 153,06 (-CH=); 138,11 (C-3, C-5);135,86 (C-2’); 133,54 (C-1’); 130,21 (C-4’); 129,06 (C-3’);127,95 (C-6’); 127,41 (C-5’). III H C N N N N1 2 4 5 3 1' 6' 5' 4' 3' 2' F 13C-NMR (CDCl3); δ (ppm) 164,27 (C-4’); 156,54 (-CH=); 138,33 (C-1’); 130,90 (C-3; C-5); 127,79 (C-2’; C-6’); 116,40 (C- 3’; C-5’).
3.3. Thử tác dụng sinh học
Với mục đích tìm kiếm các hoạt chất có tác dụng sinh học cao, có khả năng sử dụng làm thuốc, chúng tôi tiến hành thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được. Kết quả nghiên cứu về tác dụng sinh học của các hợp chất triazol đã được công bố và trình bày ở phần tổng quan gợi ý cho chúng tôi định hướng thăm dò các tác dụng kháng tế bào ung thư và kháng nấm của các chất tổng hợp được.
3.3.1. Thử tác dụng kháng các dòng tế bào ung thư người
Chúng tôi đã tiến hành thử tác dụng kháng tếbào ung thư người của bốn chất tổng hợp được lựa chọn một cách ngẫu nhiên, trên bốn dòng tế bào ung thư người là A549, Hela, Hep-G2, OVCA-8, tại Khoa Dược Lý - Viện Dược Liệu - Bộ Y tế. Kết quả thử tác dụng gây độc tế bào của bốn trong số tám chất tổng hợp được được trình bày trong bảng 3.7.
Bảng 3.7. Tác dụng của các mẫu thử ở nồng độ 100 μg/ml trên một số dòng tế bào ung thư
ST T Ký hiệu mẫu Dòng tế bào % sống sót Kết luận
A549 Hela Hep-G2 OVCA-8
1 DMSO 100,0 100,0 100,0 100,0 2 Adriamycin 27,7 10,8 23,6 29,5 Dương tính 3 II 80,8 91,4 112,0 70,4 Âm tính 4 III 95,5 110,1 94,6 92,8 Âm tính 5 IV 77,7 84,1 79,1 90,2 Âm tính 6 VII 77,1 99,5 99,6 73,7 Âm tính 3.3.2. Thử tác dụng kháng nấm
Việt Nam là một nước có điều kiện khí hậu rất thuận lợi cho sự phát triển của các chủng nấm gây bệnh. Do đó nhu cầu tìm kiếm các chất tổng hợp hóa
dược có tác dụng kháng các chủng nấm tốt và độc tính thấp cho cơ thể ngày càng đa dạng. Xuất phát từ nhu cầu này cùng với những tác dụng sinh học tham khảo được đã trình bày ở phần tổng quan, định hướng chúng tôi thử tác dụng kháng nấm của một số chất tổng hợp được.
Tại phòng Sinh học thực nghiệm-Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên (Viện khoa học và công nghệ Việt Nam), 4 chất do chúng tôi tổng hợp (II,
III, IV, VII) đã được thử hoạt tính kháng nấm. Kết quả được trình bày ở bảng 3.8.
Bảng 3.8: Kết quả thử hoạt tính kháng nấm
Chất Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): µg/ml
Nấm mốc Nấm men
Asp. niger F. oxysporum S. cerevisiae C. albicans
II 25 (-) (-) 50 III 12,5 (-) (-) 25 IV 25 (-) (-) 50 VII 50 (-) (-) 50 3.4. Bàn luận. 3.4.1 Về tổng hợp hóa học a.Về phản ứng tổng hợp 4-amino-4H-triazol.
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát phản ứng tổng hợp 4-amino-4H-triazol (I) theo hai phương pháp của hai tác giả đã công bố là phương pháp của E.C. Horning [26] và phương pháp của M.V. Rubtsov; A.G. Baichikov [42].
Qua kết quả thực nghiệm chúng tôi thấy phản ứng tổng hợp (I) theo phương pháp của E.C. Horning [26] phức tạp hơn so với phương pháp của M.V. Rubtsov; A.G. Baichikov [42]. Phản ứng tổng hợp theo phương pháp này trải qua hai giai đoạn bao gồm giai đoạn phản ứng tạo formyl hydrazin kéo dài 18h sau đó cất quay loại nước và ethanol để thu được sản phẩm trung
gian formyl hydrazin, sau đó mới tiếp tục tiến hành đun nóng formyl hydrazin để thu được sản phẩm. Mà hiệu suất phản ứng chỉ đạt 55%.
Tổng hợp (I) phương pháp của M.V. Rubtsov; A.G. Baichikov [42] có ưu điểm là thời gian phản ứng ngắn hơn là 4h. Tuy nhiên, theo quy trình gốc tác giả công bố thì nguyên liệu hydrazin hydrat phải là loại 85%. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát phản ứng tổng hợp với hydrazin hydrat 50%. Kết quả cho thấy sử dụng hydrazin hydrat 50% phản ứng tổng hợp (I) ổn định và hiệu suất đạt 77,3%, cao hơn so với công bố của tác giả Nguyễn Văn Yên [13]. Tác giả Nguyễn Văn Yên đã tiến hành tổng hợp (I) với nguyên liệu hydrazin hydrat 85% và thu được sản phẩm (I) với hiệu suất 71%. Qua quá trình thực nghiệm chúng tôi nhận thấy phản ứng tổng hợp (I) dễ thực hiện và để có hiệu suất cao cần lưu ý một số điều kiện phản ứng sau:
- Nhiệt độ phản ứng duy trì ở 2000
C trong 4 giờ có khuấy trộn tốt.
- Do phản ứng ngưng tụ tạo ra một lượng H2O lớn do đó phản ứng phản thực hiện với thiết bị sinh hàn ngang để liên tục cất H2O ra khỏi hỗn hợp phản ứng. Sau khi tổng hợp xong cần tiến hành tinh chế và bảo quản ngay trong bình hút ẩm chân không để trành hiện tượng hút ẩm, biến màu của sản phẩm.
b. Về phản ứng tổng hợp các azomethin của 4-amino-4H-1,2,4- triazol
Phản ứng ngưng tụ của chất (I) với các aldehyd thơm có các nhóm thế khác nhau diễn ra tương đối dễ dàng ở điều kiện đun hồi lưu các chất phản ứng trong dung môi EtOH thời gian phản ứng tùy thuộc vào cấu tạo của các andehyd.
Với các aldehyd thơm có các nhóm hút diện tử (-M và -I) phản ứng dễ xẩy ra hơn do làm tăng mức độ phân cực của nhóm chức CHO dẫn tới làm tăng mức độ tích điện (+) trên nguyên tử carbon.
C Carom
C N
3.4.2.1.Về phổ hồng ngoại (IR)
Tám chất tổng hợp được (I-VIII) đã được tiến hành ghi phổ hồng ngoại. Qua phân tích phổ đồ phổ hồng ngoại của các chất chúng tôi nhận biết được các dải hấp thụ đặc trưng của các nhóm chức và các liên kết có trong cấu trúc phân tử của các chất tổng hợp được. Kết quả phân tích phổ được trình bày ở bảng 3.3. Sau đây là một số bàn luận:
Phổ hồng ngoại IR của chất I có dải hấp thụ của nhóm amin bậc nhất (- NH2) (νNH2= 3482cm-1).
Phổ IR của 7 chất (II-VIII) đều xuất hiện dải hấp thụ của nhóm >C=N trong vùng 1685cm-1-1595cm-1 và không còn dải hấp thụ của nhóm amin bậc nhất (-NH2) chứng tỏ phản ứng ngưng tụ của nhóm amin bậc nhất (-NH2) với các aldehyd thơm đã xảy ra và sản phẩm azomethin đã được tạo thành.
Hai chất V và VII, trong cấu trúc phân tử có nhóm nitro (-NO2) do đó trên phổ đồ xuất hiện hai dải hấp thụ có cường độ mạnh đặc trưng dao động hóa trị đối xứng và bất đối xứng của nhóm NO2 (νasNO2 trong vùng từ 1524cm-1 - 1519 cm-1 và νsNO2trong vùng từ 1362 cm-1
- 1345 cm-1).
Trong cấu trúc phân tử hai chất II và VII có chứa nguyên tử Clo, trên phổ đồ xuất hiện dao động hóa trị đặc trưng của liên kết Carom.- Cl trong vùng 1054 -1053 cm-1. Tương tự, phổ đồ phổ hồng ngoại của chất III xuất hiện dải hấp thụ dặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết Carom.-F có số sóng là 1233cm-1.
Phổ đồ phổ hồng ngoại của chất VI cũng cho phép nhận biết sự có mặt của nhóm OH phenol bởi sự xuất hiện dải hấp phụ đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết Carom.-OH ở số sóng 3118cm-1
.
Phổ IR của 8 chất đều có dải hấp thụ đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết của nhân benzen trong vùng 1641 – 1502cm-1
và 1567 1297cm-1 và dải hấp thụ đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết của dị vòng trong vùng 1505cm-1
Các số liệu phân tích phổ IR của các chất tổng hợp được phù hợp với số liệu công bố trong các tài liệu tham khảo được [9], [10], [44].
3.4.2.2.Về phổ khối lượng (MS)
Bảy chất tổng hợp được (II-VIII) đã được ghi phổ khối lượng. Từ kết quả trình bày ở bảng 3.4, có thể nhận thấy 7 chất được ghi phổ có pic phân tử có số khối đúng bằng số khối của chất dự kiến và phù hợp với quy tắc Nitơ. Do phương pháp ghi phổ khối lượng sử dụng phương pháp bắn phá ion nhẹ nhàng nên phân tử không bị bắn phá thành các mảnh nhỏ hơn. Trên phổ đồ chỉ xuất hiện pic của ion phân tử.
3.4.2.3. Về phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (13C-NMR) của chất I, II, III
Việc phân tích phổ cộng hưởng từ proton (1
H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (13
C-NMR) được thực hiện đối với chất trung gian và hai chất mới chưa thấy công bố trong các tài liệu tham khảo được là chất II và chất III.
* Về phổ 1
H-NMR
Phổ cộng hưởng từ proton cho phép nhận biết dạng proton và số lượng proton từng dạng của chất được ghi phổ qua số liệu về độ dịch chuyển hoá học (δ) và cường độ của các pic được trình bày ở bảng 3.6. Số lượng tín hiệu proton xuất hiện trong phổ đồ bằng với số lượng nguyên tử hydro có trong cấu trúc dự kiến của chất.
+ Phổ cộng hưởng từ proton của chất I cho phép nhận biết 2 proton của nhóm -NH2 có độ dịch chuyển hóa học là 4,70ppm và 2 proton H-3 và H-5 của dị vòng 1,2,4-triazol có độ dịch chuyển hóa học là 8,32ppm.
+ Phổ cộng hưởng từ proton của chất II và III không còn sự xuất hiện tín hiệu của 2 proton của nhóm -NH2, thay vào đó phổ đồ của chất II sự xuất hiện của proton của nhóm –CH=N- có độ dịch chuyển hóa học là 9,05ppm. Tuy nhiên, tín hiệu này đã bị xen phủ trên phổ đồ của chất III, vì vậy, không cho
phép nhận biết proton này trên phổ đồ của chất III, các proton còn lại đều xuất hiện rõ ràng trên phổ đồ.
* Về phổ 13
C-NMR
Kết quả phân tích phổ được trình bày ở bảng 3.6 cho thấy chất có số carbon và độ dịch chuyển hoá học δ của các vị trí carbon phù hợp với công thức dự kiến.
Phổ của cả 2 chất II và III chất đều có tín hiệu nhóm –CH= với độ dịch chuyển 153,06 – 156,54 ppm.
phổ 13
C-NMR của cả 3 chất được ghi phổ đều có tín hiệu của nguyên tử carbon tại vị trí 3, 5 trong vòng 1,2,4-triazol (C-3, C-5) với độ dịch chuyển hóa học là trong vùng từ 138,11- 144,66 ppm.
Kết luận: Kết quả phân tích phổ IR, MS, 1
H-NMR và 13C-NMR cho phép chúng tôi kết luận các chất tổng hợp được có cấu trúc đúng như dự kiến.
3.4.3. Về tác dụng sinh học.
3.4.3.1. Tác dụng kháng các dòng tế bào ung thư
Từ kết quả thử hoạt tính sinh học cho thấy cả 4 chất thử tác dụng bao gồm II, III, IV , VIIđều không có hoạt tính kháng tế bào ung thư.
Từ kết quả trên có thể thấy rằng sự cản trở không gian cho vòng triazol có vai trò quan trọng quyết định hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư. Các chất được chúng tôi thử nghiệm đều không có sự cản trở không gian, trong khi đó với các thuốc điều trị ung thư vú là anastrozole, letrozole [39], [41] trình bày trong phần tổng quan, nhờ sự che chắn của các nhân thơm mà các chất này có tác dụng.
3.4.3.2. Tác dụng kháng nấm
Kết quả thử hoạt tính kháng nấm của 4 chất II, III, IV và VII cho thấy cả 4 chất đều có tác dụng trên hai chủng vi nấm đó là chủng nấm mốc Asp. niger và chủng nấm men Candida albicans ở mức độ khác nhau với MIC từ
12,5 - 50µg/ml. Cả 4 chất thử nghiệm đều không thể hiện hoạt tính kháng chủng nấm mốc F. oxysporum và chủng nấm men S. Cerevisae.
Từ bảng kết quả 3.8 có thể nhận thấy tác dụng kháng hai chủng vi nấm của chất III, chất có chứa nguyên tử fluorotrong phân tử,có tác dụng kháng mạnh nhấttrên chủng nấm mốc Asp. niger và chủng nấm men Candida albicans, mạnh hơn so với chất II, IV và chất VII với MIC = 12,5 µg/ml. Điều này cũng phù hợp với các tài liệu đã công bố [2], [4], [18], [27-30], [35], [47] về hoạt tính kháng nấm của dẫn chất triazol có chứa nguyên tử fluoro trong phân tử.
Từ kết quả thử nghiệm này có thể rút ra nhận xét sơ bộ là bản thân yếu tố cấu trúc azomethin của 4-amino-4H-1,2,4-triazol đã mang hoạt tính kháng nấm trên hai chủng vi nấm, chủng nấm mốc Asp. niger và chủng nấm men
Candida albicans cho các chất tổng hợp được. Việc gắn nguyên tử Fluoro vào vị trí 4 của vòng thơm của hợp phần aldehyd đã làm tăng hoạt tính kháng nấm này. Kết quả thử nghiệm này phù hợp với định hướng nghiên cứu của chúng tôi khi tiến hành tổng hợp các dẫn chất azomethin của 4-amino-4H-1,2,4- triazol. Để có được nhận xét toàn diện hơn cần tiến hành thử tác dụng của tất cả các chất tổng hợp được.
So sánh kết quả thử tác dụng kháng nấm của các chất được thử nghiệm chúng tôi thấy:
- Đối với tác dụng kháng chủng vi nấm Asp. niger các chất có yếu tố cấu trúc chức các nguyên tử halogen trong phân tử (II, III, IV) thì hoạt tính kháng nấm mạnh hơn so với chất thử nghiệm không chứa nguyên tử halogen trong phân tử.
- Tuy nhiên, điều này không có tính quy luật lặp lại trên chủng vi nấm
Candida albicans. Trên chủng vi nấm Candida albicans chỉ duy nhất chấtIII,
với MIC = 25 µg/ml. Các chất còn lại có chứa nguyên tử clo (II, IV) và không chứa nguyên tử halogen trong cấu trúc phân tử thì lại thể hiện hoạt tính kháng nấm ở mức độ tương đương với MIC = 50 µg/ml.