Xác định hàm ẩm dược liệu tươi
Tiến hành lần lượt dược liệu phần trên mặt đất (T) và phần dưới mặt đất (D): Cân khoảng 1g (T) và 1 g (D) đã nghiền nhỏ, bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 80o, đổ lần lượt (T) và (D) lên đĩa cân, trải đều, đậy nắp. Đợi kết quả trên màn hình. Làm từng mẫu 2 lần để lấy kết quả trung bình.
Kết quả: Hàm ẩm của phần trên mặt đất: aT= 74,35% Hàm ẩm của phần dưới mặt đất: aD= 71,35%
Tiến hành cất tinh dầu
Cân phần trên mặt đất: mT= 6,2kg, phần dưới mặt đất: mD= 2,4kg. Tiến hành cất riêng biệt một lần trong nồi cất lớn phần trên và dưới mặt đất.
Kết quả:
Phần trên mặt đất: VT= 2,5ml; phần dưới mặt đất: VD= 0,85ml
Tinh dầu phần trên mặt đất và dưới mặt đất không màu, trong, nhẹ hơn nước, có mùi thơm đặc trưng.
Áp dụng công thức tính hàm lượng tinh dầu: X% =
a × m m V ×100%
Ta được: Hàm lượng tinh dầu phần trên mặt đất: XT% = 0,16% Hàm lượng tinh dầu phần dưới mặt đất: XD% = 0,12%
3.5. Định tính bằng phản ứng hoá học
Định tính riêng bột dược liệu phần trên mặt đất (T) và phần dưới mặt đất (D)
3.5.1. Định tính flavonoid.
Tiến hành lần lượt hai phần (T) và (D) theo các bước sau: Cân khoảng 10g bột (T) và 10g bột (D) cho vào bình nón 100ml, thêm 50ml cồn 90°. Đun cách thủy 10 phút, lọc nóng, lấy dịch lọc làm các phản ứng sau:
a. Phản ứng Cyanidin (Phản ứng Shinoda)
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm một ít bột magnesi kim loại (khoảng 10mg). Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3 – 5 giọt). Để yên một vài phút, dung dịch phần (T) và (D) đều xuất hiện màu đỏ.
Kết quả: Phần (T) và (D) đều có phản ứng dương tính.
b. Phản ứng với kiềm
- Phản ứng với hơi amoniac: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô, rồi hơ trên miệng lọ có chứa amoniac đặc đã mở nút, đối chiếu với tờ giấy nhỏ giọt dịch chiết đối chứng thấy màu vàng của vết đậm lên rõ rệt.
Kết quả: Phần (T) và (D) đều có phản ứng dương tính.
- Phản ứng với dd NaOH 10%: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%, thấy dịch chiết phần (T) và (D) đều chuyển từ vàng sang vàng đậm, khi đun nóng thấy xuất hiện màu đỏ.
Kết quả: Phần (T) và (D) đều có phản ứng dương tính.
c. Phản ứng với FeCl3 : Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%.
Kết quả: Phần (T) và (D) đều xuất hiện tủa xanh đen → Phản ứng dương tính.
d. Phản ứng diazo hóa
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm (dung dịch NaOH, KOH, Na2CO3), thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều, đun nóng trên nồi cách thủy trong vài phút.
Kết quả: Phần (T) và (D) đều xuất hiện màu đỏ→Phản ứng dương tính.
Nhận xét: Phản ứng dương tính với kiềm, diazo, FeCl3 và cyanidin
Sơ bộ kết luận: phần trên và phần dưới mặt đất Sa nhân tím đều có chứa flavonoid.
3.5.2. Định tính coumarin.
Tiến hành lần lượt hai phần (T) và (D) theo các bước sau: Lấy khoảng 10g cho vào bình nón 100ml, thêm 50ml cồn 90°. Đun cách thủy 5 phút, lọc nóng qua bông. Dịch lọc thu được dùng làm các phản ứng sau:
a. Phản ứng mở đóng vòng lacton :
- Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết Ống 1 thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10% Ống 2 để nguyên.
Ống 1: không có màu vàng hoặc tủa đục màu vàng Ống 2: Trong
- Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2ml nước cất. Lắc đều rồi quan sát Ống 1: Trong suốt
Ống 2: không có tủa
→ Phần (T) và (D) đều không có phản ứng đóng mở vòng lacton.
b. Phản ứng diazo hóa
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm (dung dịch NaOH, KOH, Na2CO3), thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều, đun nóng trên nồi cách thủy trong vài phút. Dung dịch của cả hai phần (T) và (D) đều không đổi màu → Phần (T) và (D) đều âm tính với phản ứng diazo hoá.
c. Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm (Phản ứng chuyển từ đồng phân cis sang đồng phân trans dưới tác dụng của tia tử ngoại)
Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy lọc. Nhỏ tiếp vài giọt dung dịch NaOH 5%. Sấy nhẹ. Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một đồng xu rồi chiếu tia tử ngoại trong một vài phút. Bỏ đồng xu ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại thấy: phần không bị che có huỳnh quang không khác phần bị che.
→Phần (T) và (D) đều âm tính với phản ứng huỳnh quang.
d. Vi thăng hoa
Cho một ít bột dược liệu vào nắp chai bằng nhôm. Đặt lên bếp điện có lưới amian, cho bay hết hơi nước trong dược liệu. Đặt trên miệng nắp nhôm một phiến kính trên đó có đặt ít bông thấm nước lạnh. Đun nhẹ dưới nắp nhôm, sau 5 phút lấy lam kính ra, để nguội, soi dưới kính hiển vi không thấy tinh thể hình kim. Nhỏ thêm 1 giọt dd KI 10% lên phiến kính, soi dưới kính hiển vi vẫn không quan sát thấy tinh thể hình kim → Phần (T) và (D) đều không có hiện tượng vi thăng hoa.
Sơ bộ kết luận:phần trên mặt đất và phần dưới mặt đất Sa nhân tím đều không chứa coumarin.
3.5.3. Định tính saponin.
Tiến hành lần lượt hai phần (T) và (D) theo các bước sau:
a. Quan sát hiện tượng tạo bọt: Cho vào ống nghiệm lớn 0,1g bột dược liệu, thêm 5ml nước. Lắc mạnh trong 5 phút. Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt.
Kết quả : Phần (T) và (D) đều có bọt bền vững sau 30 phút.
b. Phản ứng phân biệt Saponin steroid và Saponin triterpenoid: Lấy 1g bột nguyên liệu cho thêm 5ml cồn đun sôi cách thủy trong 15 phút. Lấy 2 ống nghiệm cỡ bằng nhau, cho vào ống thứ nhất 5ml HCl 0.1N (pH=1) và ống thứ hai 5ml NaOH 0.1N (pH=13). Cho thêm vào mỗi ống 2-3 giọt dung dịch cồn chiết rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả 2 ống trong 15s. Để yên thì quan sát thấy cả hai mẫu (T) và (D) đều có cột bọt trong ống kiềm cao hơn → Phần (T) và (D) đều chứa saponin steroid.
Sơ bộ kết luận: phần trên mặt đất và phần dưới mặt đất Sa nhân tím đều có chứa saponin steroid.
3.5.4. Định tính alcaloid.
Tiến hành lần lượt hai phần (T) và (D) theo các bước sau: Cân 10g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml. Thêm 15ml dung dịch acid sulfuric 1N. Đun đến sôi. Để nguội. Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100ml. Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N (khoảng 8ml) đến pH = 9 - 10 (thử bằng giấy quỳ). Chiết alcaloid base bằng cloroform (chiết 3 lần, mỗi lần 5ml). Gộp các dịch chiết cloroform, loại nước bằng natrisulfat khan, sau đó dùng để làm phản ứng định tính. Lấy một phần dịch chiết cloroform đã được chuẩn bị ở trên, đem lắc với acid sulfuric 1N hai lần, mỗi lần 5ml. Gộp các dịch chiết nước. Chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml. Nhỏ vào từng ống nghiệm 2 - 3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:
- Ống 1: thuốc thử Mayer, dung dịch cả hai phần đều không đổi màu cũng như không xuất hiện tủa màu.
- Ống 2: thuốc thử Bouchardat, dung dịch cả hai phần đều không đổi màu cũng như không xuất hiện tủa màu.
- Ống 3: thuốc thử Dragendorff, dung dịch cả hai phần đều không đổi màu cũng như không xuất hiện tủa màu.
→ Phần (T) và (D) đều âm tính với ba phản ứng trên.
Sơ bộ kết luận: phần trên mặt đất và phần dưới mặt đất Sa nhân tím đều không chứa alcaloid.
3.5.5. Định tính tanin
Tiến hành lần lượt hai phần (T) và (D) theo các bước sau: Lấy khoảng 1,00g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 20ml nước cất, đun sôi trong 2 phút. Để nguội, lọc. Dịch lọc được dùng để định tính.
a. Ống 1: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% (TT). Dung dịch cả hai phần (T) và (D) đều xuất hiện màu hoặc tủa màu xanh đen hoặc xanh nâu nhạt. b. Ống 2: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10% (TT). Dung dịch cả hai phần (T) và (D) đều không xuất hiện tủa bông.
c. Ống 3: lấy 2ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1%. Dung dịch cả hai phần (T) và (D) đều không xuất hiện tủa bông trắng.
Kết quả: Phần (T) và (D) dương tính với phản ứng với FeCl3, nhưng phản ứng đặc trưng của tanin là phản ứng gelatin lại cho kết quả âm tính.
Sơ bộ kết luận: phần trên mặt đất và phần dưới mặt đất Sa nhân tím đều không có tannin.
3.5.6. Định tính anthranoid.
Tiến hành lần lượt hai phần (T) và (D) theo các bước sau:
a. Phản ứng Borntraeger
Định tính anthranoid toàn phần (dạng glycosid và dạng tự do): Cho vào ống nghiệm lớn 1g từng phần (T) và (D). Thêm 5ml dung dịch acid sulfuric 1N. Đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến sôi. Tiếp tục lọc và chiết như ở trên.
- Lấy 1ml dịch chiết cloroform, thêm 1ml dung dịch amoniac. Lắc nhẹ. Lớp nước của cả hai phần đều không đổi màu.
- Lấy 1ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%. Lắc nhẹ. Lớp nước của cả hai phần đều không đổi màu.
→ Phần (T) và (D) đều cho phản ứng âm tính.
b. Vi thăng hoa:
Trải bột dược liệu thành lớp mỏng trong một nắp chai bằng nhôm, đốt nhẹ trên đèn cồn để loại nước. Sau đó đậy lên nắp nhôm một miếng lam kính, bên trên có miếng bông đã thấm nước, tiếp tục đun nóng trong khoảng 5 – 10 phút. Lấy lam kính ra để nguội, soi kính hiển vi. Không nhìn thấy hình ảnh tinh thể ở cả hai phần (T) và (D).
Sơ bộ kết luận: phần trên mặt đất và phần dưới mặt đất Sa nhân tím đều không có anthranoid.
3.5.7. Định tính glycosid tim.
Tiến hành lần lượt hai phần (T) và (D) theo các bước sau: Lấy 3g dược liệu, chiết soxhlet với n-hexan 1 giờ. Bã dược liệu sấy khô, cho vào bình cầu, đun hồi lưu với ethanol 40% trong 1 giờ. Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ, thêm khoảng 3ml chì acetat 30%, khuấy đều. Lọc loại tủa, thử dịch lọc vẫn còn tủa với chì acetat, cho thêm 1ml chì acetat nữa vào dịch chiết, khuấy và lọc lại. Tiếp tục thử đến khi dịch chiết không còn tủa với chì acetat. Cho toàn bộ dịch lọc vào bình gạn và lắc kỹ với hỗn hợp chloroform-ethanol tỷ lệ 4:1 (3 lần, mỗi lần 5ml), gạn lấy lớp chloroform vào cốc có mỏ khô sạch. Chia dịch chiết vào 6 ống nghiệm nhỏ, bốc hơi dung môi trên nồi cách thuỷ cho đến khô. Cắn còn lại để làm các phản ứng định tính sau:
a. Phản ứng của khung steroid: Phản ứng Liebermann – Burchardat
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn. Nghiêng ống 450. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
Kết quả: Phần (T) và (D) đều xuất hiện vòng đỏ giữa hai lớp chất lỏng, lớp dưới màu hồng nhạt, lớp trên màu xanh lá → Phản ứng dương tính.
b. Phản ứng của vòng lacton 5 cạnh
- Phản ứng Baljet: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet (1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%) mới pha.
Kết quả: Phần (T) và (D) đều không xuất hiện màu đỏ cam đậm hơn ống chứng → Phản ứng âm tính.
- Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ 1 giọt thuốc thử Natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc đều.
Kết quả: Phần (T) và (D) đều không xuất hiện màu đỏ cam → Phản ứng âm tính.
c. Phản ứng của phần đường 2,6 – desoxy: Phản ứng Keller – Kiliani
Cho vào ống nghiệm chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic. Lắc đều. Nghiêng ống 450. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulphuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Phần (T) và (D) đều chỉ xuất hiện vòng đỏ → Phản ứng dương tính nhẹ.
Nhận xét: Chỉ có phản ứng của phần đường là dương tính (không đặc trưng) Sơ bộ kết luận: phần trên mặt đất và phần dưới mặt đất Sa nhân tím đều không có glycosid tim.