- Tính chất: Bằng cảm quan cao đặc phải đạt các yêu cầu đã nêu ở trên.
- Độ ẩm: Tiến hành theo phương pháp cất với dung môi theo DĐVN IV, phụ lục 12.13 (dùng 9 - 10g cao đặc)
- Định tính:
+ Định tính các nhóm chất hữu cơ: Phương pháp hóa thực vật thường quy. Cách tiến hành như mục 3.3.2 trang 47 - 51.
+ Định tính bằng SKLM: Cách tiến hành như mục 3.3.3 trang 53 - 58.
- pH: Sử dụng máy đo pH. Cách tiến hành như mục 3.3.1.3 trang 45.
- Chất chiết được trong nước: Dùng phương pháp chiết lạnh. Tiến hành theo phụ lục 12.10 DĐVN IV.
- Tro toàn phần: Tiến hành theo DĐVN IV, phụ lục 9.8 (dùng 1,00g cao đặc) 3.4.3. Đóng gói và bảo quản: Đóng trong bao bì chống ẩm, để nơi khô mát. 3.5. Thử tác dụng chống viêm cấp của cao đặc
Tiến hành:
Chuẩn bị chế phẩm thử: Cân chính xác 5,6g cao đặc, hòa tan vào 20ml nước cất, pha hàng ngày cho chuột uống
Chuẩn bị thuốc đối chiếu: Methylprednisolon 20mg (tương đương 5 viên Medrol 4mg) pha với 20ml nước, pha hàng ngày cho chuột uống.
Chuẩn bị dầu croton: Dầu croton được pha trong aceton với công thức như sau: Pha 40 mg dầu croton vào 2 ml aceton (như vậy trong mỗi 20 µl hỗn hợp sẽ chứa 0,4 mg dầu croton).
Tiến hành thí nghiệm:
Chuột nuôi ổn định 1 tuần, chọn những con có khối lượng từ 22 – 26g, chia ngẫu nhiên thành 3 lô thí nghiệm, mỗi lô 10 con như sau:
+ Lô 1 (Mô hình): Gây mô hình ở tai phải + Uống nước cất 0,2 mg/10g trọng lượng chuột.
+ Lô 2 (Methylprednisolon): Gây mô hình + Uống methylprednisolon 20 mg/kg thể trọng một lần duy nhất.
+ Lô 3 (thuốc thử): Gây mô hình + Uống cao đặc đã pha (5,6g cao đặc/kg thể trọng), với thể tích 0,2 ml/10g trong 3 ngày liên tục.
Chuột được uống nước cất hoặc thuốc thử 2 ngày trước khi làm nghiên cứu và ngày thứ 3 trước khi gây mô hình 1 giờ với liều lượng như trên. Một giờ sau khi uống nước cất hoặc thuốc thử lần thứ 3, toàn bộ chuột được gây mô hình bằng dầu croton trên tai phải (mặt ngoài của tai chuột được bôi bằng pipet 20 µl dung dịch dầu croton (trong aceton) để gây mô hình viêm tai).
Ở tất cả các chuột, tai trái không gây mô hình và không bôi thuốc gì. Nhiều nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng aceton không gây ảnh hưởng gì tới tai chuột [31], [32].
Trước khi gây mô hình bằng dung dịch dầu croton (trong aceton), chuột được đo chiều dày tai ở tất cả các lô. Đo chiều dày tai tại vị trí sát đỉnh của tai cách xa chóp sụn vành tai. Chỉ một nghiên cứu viên tiến hành đo chiều dày tai để hạn chế sai số. 6 giờ sau khi gây mô hình, chuột được gây mê bằng thiopental, tai chuột được đo lại chiều dày, sau đó cắt ở phần trung tâm với đường kính 7 mm bằng dụng cụ sinh thiết để đo cân nặng.
Kết quả: được trình bày ở các bảng 3.18, 3.19, 3.20 và phụ lục 1.
a. Cân nặng trung bình các lô chuột
Bảng 3.18. Cân nặng trung bình của các lô chuột
Lô 1 Mô hình Lô 2 Methylprednisolon Lô 3 Cao thuốc Cân nặng ( SD,g) 24,4 1,3 25,1 2,0 24,8 1,8 Bảng 3.18 cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (test ANOVA) về cân nặng giữa các lô với nhau. Khi so sánh từng lô với lô mô hình (t-test student)
cũng không cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Điều này đảm bảo sự tương đồng về mặt sinh học giữa các lô chuột thí nghiệm.
b. Chiều dày và khối lượng tai chuột
* Chiều dày tai chuột
Chuột được đo chiều dày tai bên phải trước và sau khi gây mô hình 6 giờ. Kết quả được trình bày ở bảng 3.19.
Bảng 3.19. Chiều dày tai phải của chuột trước và sau khi gây mô hình 6h.
n
Chiều dày tai chuột
( SD,µm)
Trước Sau 6h
Lô 1: Mô hình 10 21,20 3,29 27,00 3,68+ Lô 2: Methylprednisolon 10 21,00 4,32 23,40 3,12* Lô 3: Cao thuốc 10 21,80 4,05 25,60 1,58+ Ghi chú: +: Khác biệt so với trước, test t ghép cặp, p < 0,05
*: Khác biệt so với lô mô hình tại cùng thời điểm, test t-Student, p < 0,05 Từ kết quả bảng 3.19 thấy:
Không có sự khác biệt về chiều dày tai bên phải ở thời điểm trước nghiên cứu giữa các lô (test ANOVA). Kết quả này phù hợp với kết quả ở bảng 3.18: Tương đồng sinh học giữa các lô chuột được đảm bảo.
Đối với lô 1 mô hình chỉ được bôi dầu croton, chiều dày của tai phải tăng lên rõ rệt, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với ban đầu (test t ghép cặp), điều đó cho thấy tác dụng gây viêm cấp của dầu croton trên tai chuột nhắt.
Lô 2 uống methylprednisolon chiều dày tai có tăng nhưng không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với trước nghiên cứu (test t ghép cặp). Chiều dày tai của lô uống methylprednisolon có khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình tại cùng thời điểm (test t Student). Điều này cho thấy methylprednisolon đường uống có tác dụng chống viêm cấp rõ rệt gây ra bởi dầu croton trên tai chuột.
Lô 3 uống thuốc thử (cao thuốc): Đều cho thấy xu hướng giảm so với lô mô hình, tuy nhiên sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (test t Student). Chiều dày tai bên phải tại thời điểm 6 giờ sau khi gây mô hình vẫn tăng có ý nghĩa thống kê so với trước khi gây mô hình.
* Khối lượng tai chuột, mức độ ức chế viêm
Tai chuột cả 2 bên được lấy ở phần trung tâm với đường kính 7 mm bằng thiết bị sinh thiết tại thời điểm 6 giờ, sau đó cân trên cân điện tử.
Tính mức độ ức chế viêm.
Kết quả được trình bày ở bảng 3.20.
Bảng 3.20. Khối lượng tai chuột và mức độ ức chế viêm
n
Khối lượng tai chuột
( SD,µg)
Mức độ ức chế viêm
(%) Tai phải Tai trái
Lô 1: Mô hình 10 33,80 6,37 14,20 2,66
Lô 2: Methylprednisolon 10 17,60 3,31+* 12,90 1,45 44,08 Lô 3: Cao thuốc 10 30,40 2,17+ 13,90 1,52 9,17
Chú thích: +: Khác biệt so với tai bên trái, test t-Student, p < 0,001 *: Khác biệt so với lô mô hình, test t-Student, p < 0,001 Bảng 3.20 cho thấy:
Ở lô mô hình, khối lượng tai phải tăng rõ rệt so với tai bên trái, điều đó chứng tỏ tác dụng gây viêm cấp (phù nề) của dầu croton.
Ở lô uống methylprednisolon, khối lượng tai giảm rõ rệt so với lô mô hình, mức độ ức chế viêm của methylprednisolon là 44,08 %, điều này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đó cho thấy corticoid có tác dụng mạnh trên mô hình gây viêm cấp bằng dầu croton [31], [32].
Lô uống cao thuốc cũng có xu hướng giảm khối lượng tai phải so với lô mô hình tuy nhiên mức độ ức chế viêm 9,17%. Sự khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình.
Kết quả chung:
Từ các kết quả nghiên cứu trên, rút ra kết luận sau:
Cao đặc bài thuốc liều 5,6g cao/kg thể trọng (tức 23,52 g dược liệu/kg thể trọng - tương đương liều lâm sàng) chưa có tác dụng chống viêm cấp tại chỗ gây ra do dầu croton trên tai chuột nhắt trắng.
3.6. Bàn luận
Về phương pháp chiết cao:
- Chiết cao bằng dung môi ethanol 70% do ethanol là dung môi khá thông dụng, dễ kiếm, rẻ hơn các dung môi khác, không gây độc hại, ít ảnh hưởng đến môi trường, hòa tan chọn lọc được nhiều hoạt chất.
- Sử dụng phương pháp ngâm lạnh để chiết cao giúp hạn chế tác động bởi nhiệt, đồng thời hạn chế tạp chất so với các phương pháp dùng nhiệt. Tuy nhiên phương pháp này tốn nhiều thời gian và dung môi để chiết kiệt các thành phần.
- Chiết riêng từng vị sau đó phối hợp thành cao bài thuốc: Do các vị thuốc có thể chất, thành phần hóa học không giống nhau, độ hòa tan, hàm lượng hoạt chất cũng khác nhau,vì thế thời gian chiết kiệt và lượng dung môi dùng cũng khác nhau; do vậy chúng tôi tiến hành chiết riêng từng vị thuốc thành cao 1:1 rồi phối hợp với nhau tạo thành cao bài thuốc. Cách làm như vậy giúp tiết kiệm được dung môi, thời gian chiết và thời gian cô cao so với chiết hỗn hợp bột dược liệu của cả bài thuốc. Việc phối hợp cao từng vị thuốc ở dạng cao lỏng 1:1 là phù hợp vì nếu phối hợp loãng quá sẽ mất nhiều thời gian cô, nếu để cao đặc mới phối hợp thì cao sẽ khó đồng đều giữa các vị.
Điều chế cao đặc:
Để bào chế những dạng thuốc hiện đại như viên nang mềm, viên nang cứng hay viên bao phim,… thường dùng cao khô thuận tiện hơn, tuy nhiên điều chế cao khô thường gặp nhiều khó khăn như:
- Điều chế cao khô bằng phương pháp thủ công (cô trên chảo) tốn nhiều thời gian, công sức, cao dễ bị cháy khét. Nếu dùng máy cô chân không thì đòi hỏi máy phải có công suất cao, dung tích lớn, cao phải được dàn mỏng thật mỏng, như vậy tốn rất
nhiều khay, đồng thời khi cao khô, cao sẽ bám chắc vào khay, rất khó lấy, lượng cao thu được sẽ không nhiều.
- Cao khô khó bảo quản vì dễ hút ẩm.
Do đó điều chế thành cao đặc vẫn có ưu điểm hơn như bảo quản dễ hơn, ít tốn kém hơn, ít rủi ro cháy khét hơn; khi bào chế các dạng thuốc hiện đại, có thể dùng thêm các tá dược độn, rã… thích hợp, tạo hạt ướt, sấy hạt, sửa hạt rồi đóng nang hoặc dập viên.
Kiểm tra dược liệu đầu vào:
Trong quá trình kiểm nghiệm dược liệu cần có dược liệu chuẩn để đối chiếu. Tuy nhiên, hiện nay dược liệu chuẩn đúng, tốt, nguồn gốc rõ ràng, có đầy đủ hồ sơ chứng minh rất khó kiếm, nếu có giá thành lại rất cao, vì vậy chúng tôi chưa có dược liệu chuẩn để đối chiếu. Theo DĐVN IV, một dược liệu có nhiều tiêu chí kiểm tra, tốt nhất là kiểm tra tất cả các tiêu chí nếu đạt tiêu chuẩn thì dược liệu đó đạt. Tuy nhiên những dược liệu đơn giản, thông dụng, giá không đắt, dễ kiếm, ít giả mạo, thì không nên kiểm tra tất cả các tiêu chí vừa mang tính hình thức, máy móc, mà lại tốn kém không cần thiết. Nên chăng bổ sung các tiêu chí kiểm tra dư lượng thuốc trừ sâu, chất kích thích sinh trưởng, độ nhiễm phóng xạ thì thích hợp hơn với sự ô nhiễm môi trường như hiện nay. Các vị thuốc Núc nác, Kim ngân hoa, Đơn lá đỏ, Trần bì, Ké đầu ngựa, Cúc hoa, Tô mộc là những dược liệu khá thông dụng, ít giả mạo, ít nhầm lẫn và thông qua cảm quan cũng xác định được phần nào chất lượng dược liệu. Vì vậy trong khóa luận này chúng tôi mới chỉ đối chiếu với các tiêu chuẩn trong DĐVN IV để có thể đánh giá dược liệu.
Định tính sự có mặt của từng vị thuốc trong cao đặc bằng phương pháp SKLM: Thường có 2 phương pháp:
Phương pháp 1: Vị thuốc và cao thuốc cùng chiết với 1 loại dung môi, cùng 1 quy trình chiết và khảo sát trên nhiều hệ dung môi, chọn 1 hệ dung môi tách tốt nhất các thành phần để so sánh. Phương pháp này nhanh, đơn giản, ít tốn kém nhưng nó không phản ánh được nhóm hoạt chất chính của cao thuốc và vị thuốc.
Phương pháp 2: Chiết định hướng theo nhóm chất chính trong vị thuốc (ví dụ: alkaloid toàn phần hoặc flavonoid,…) Chấm sắc kí so sánh thành phần đó trong vị thuốc và cao thuốc. Chiết theo phương pháp này tốn nhiều thời gian và dung môi hóa chất, không đặc trưng cho vị thuốc lắm vì nhiều vị thuốc có cùng nhóm hoạt chất này, tuy nhiên, các hoạt chất trong dịch chiết chấm sắc kí sạch hơn nên tách vết tốt hơn, hình ảnh sắc kí đồ sắc nét hơn.
Tác dụng chống viêm cấp của cao đặc:
Lẽ ra bài thuốc phải thử tác dụng chống dị ứng mới phù hợp với định hướng của đề tài như trong phần tổng quan, nhưng thời gian và kinh phí hạn hẹp nên chúng tôi mới thử được tác dụng chống viêm. Vì viêm và dị ứng thường đi liền nhau, dị ứng gây ra viêm, một trong các triệu chứng của bệnh dị ứng đều có tình trạng viêm cấp tính do sự giải phóng các chất trung gian hóa học, chống viêm có tác dụng hạn chế dị ứng, vì vậy chúng tôi thử tác dụng chống viêm.
Các vị thuốc trong bài thuốc đều được dân gian sử dụng để chống viêm, điều trị bệnh dị ứng, tuy nhiên với liều 5,6g cao/kg thể trọng (tương đương 23,52g dược liệu/kg thể trọng) thử trên chuột nhắt trắng chưa thể hiện được tác dụng chống viêm cấp có ý nghĩa thống kê mà mới chỉ có chiều hướng làm giảm mức độ viêm trên tai chuột. Điều này có thể do liều sử dụng còn thấp, do kinh phí hạn chế nên chúng tôi mới thử một liều duy nhất, chưa thăm dò trên nhiều liều để đánh giá tác dụng. Cần tiếp tục nghiên cứu trên nhiều liều để có nhận định chính xác về bài thuốc.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận:
- Kiểm tra chất lượng dược liệu đầu vào:
Đã kiểm tra chất lượng dược liệu đầu vào cho nghiên cứu theo một số tiêu chuẩn của DĐVN IV, về cơ bản dược liệu đạt tiêu chuẩn DĐVN IV
- Bào chế cao đăc:
Đã điều chế được cao đặc 4,2:1 với hiệu suất là 23,79% ( 15 thang 1470g, điều chế được 350g cao đặc 4,2:1), theo quy trình điều chế cao đặc từ bột dược liệu, chiết lạnh với ethanol 70%, qua hai giai đoạn: chiết riêng từng vị rồi cô thành cao lỏng 1:1, sau đó phối hợp cô tiếp thành cao đặc.
- Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc:
Cao đặc phải đạt các tiêu chí sau: + Hàm ẩm cao đặc khoảng 9 - 15%
+ pH dung dịch cao thuốc 1% (kl/tt): 4,0 – 5,0
+ Hàm lượng chất chiết được trong nước không dưới 80% + Tro toàn phần của cao đặc không quá 10%
+ Định tính được các nhóm chất chính: Flavonoid, Alkaloid, Coumarin, Tannin, Saponin.
+ Định tính được các vị thuốc núc nác, kim ngân hoa, đơn lá đỏ, trần bì, ké đầu ngựa, cúc hoa, tô mộc trong cao đặc bài thuốc bằng SKLM.
- Thử tác dụng chống viêm:
Mức độ ức chế viêm của bài thuốc là 9,17% so với lô mô hình nhưng chưa có ý nghĩa thống kê.
Đề xuất
Để đánh giá bài thuốc được đầy đủ hơn cân nghiên cứu thêm một số nội dung sau: - Nghiên cứu tác dụng chống dị ứng như tác dụng kháng histamine.
- Tiếp tục nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp của bài thuốc ở mức liều cao hơn liều đã thử để chọn liều có tác dụng tốt.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1- Nguyễn Thái An (2003), Nghiên cứu dược liệu đơn lá đỏ (Excoecaria cochinchinensis Lour. var. cochinchinensis), luận án tiến sĩ trường Đại học Dược Hà Nội.
2- Nguyễn Thái An, Phạm Xuân Sinh, Cao Văn Thu, Nguyễn Thị Anh Thư (1999), “Sơ bộ thăm dò một số tác dụng sinh học của lá cây đơn lá đỏ”, Tạp chí dược học,(4), tr.20-21.
3- Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội (2009), Bài giảng dược liệu tập I, trường đại học Dược Hà Nội, Hà Nội.
4- Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội (2009), Bài giảng dược liệu tập II, trường đại học Dược Hà Nội, Hà Nội.
5- Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội (2009), Thực tập dược liệu (kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hóa học), trường đại học Dược Hà Nội, Hà Nội.
6- Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội (2009), Thực tập dược liệu (phần nhận thức cây thuốc, vị thuốc), trường đại học Dược Hà Nội, Hà Nội. 7- Bộ môn Y học cổ truyền – trường Đại học Y Hà Nội (2008), Y học cổ truyển,
nhà xuất bản Y học, Hà Nội
8- Bộ Y tế (2006), Dược học cổ truyền, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
9- Bô Y tế (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm tập 1 – kỹ thuật sản xuất thuốc