Các dược liệu mua về được sơ chế sạch để kiểm tra chất lượng. Việc kiểm tra chất lượng được đối chiếu với tiêu chuẩn ghi trong DĐVN IV.
- Mô tả: quan sát trực tiếp bằng mắt thường mô tả đặc điểm bên ngoài của dược liệu, dùng vị giác, khứu giác để xác định mùi vị.
- Soi bột: Bằng phương pháp vi học theo tiêu chuẩn DĐVN IV.
- Định tính các vị thuốc: Phương pháp hóa thực vật thường quy theo tiêu chuẩn DĐVN IV.
- Xác định chất chiết được trong dược liệu: Phương pháp chiết nóng dùng ethanol làm dung môi (Tiến hành theo phụ lục 12.10 DĐVN IV)
Công thức tính: (sử dụng 2,000g dược liệu với 50,0ml dung môi)
Trong đó: C: Hàm lượng chất chiết được bằng ethanol của dược liệu (%) m2: Tổng khối lượng cốc và cắn (g)
m1: Khối lượng cốc (g)
m: Khối lượng dược liệu đem thử (g) H: Độ ẩm của dược liệu (%)
- Độ ẩm:
+ Phương pháp mất khối lượng do làm khô (Tiến hành theo phụ lục 9.6 DĐVN IV) Công thức tính:
Trong đó: H: Độ ẩm của dược liệu (%)
m: Khối lượng cốc (g)
m1: Khối lượng dược liệu đem đo độ ẩm (g) m2: Khối lượng cốc và dược liệu sau khi sấy (g)
+ Phương pháp cất với dung môi (Tiến hành theo phụ lục 12.13 DĐVN IV) Công thức tính:
Trong đó: H: Độ ẩm dược liệu (%)
V1: Số ml nước cất được sau lần cất đầu. V2: Số ml nước cất được sau hai lần cất. m: Số g mẫu đã cân đem thử.
2.3.2. Điều chế cao đặc
Chiết riêng từng vị thuốc bằng phương pháp ngâm lạnh ở nhiệt độ phòng với
dung môi là ethanol 70%, chiết đến khi dịch thu được nhạt màu, lọc, cất thu hồi dung môi, cô cách thủy được cao lỏng 1:1 thì phối hợp cao của 7 vị thuốc, cô cách thủy đến khi thu được cao đặc [9].
Tiến hành chiết 3 mẻ.
Xác định hiệu suất chiết cao và tỷ lệ cao đặc thu được theo công thức:
Trong đó: H: Hiệu suất chiết cao (%)
m2: Tổng khối lượng các dược liệu sử dụng để chiết cao (g) m1: Khối lượng cao đặc thu được (g)
2.3.3. Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cao đặc 2.3.3.1. Khảo sát các chỉ tiêu hóa lý: 2.3.3.1. Khảo sát các chỉ tiêu hóa lý: 2.3.3.1. Khảo sát các chỉ tiêu hóa lý:
- Nhận xét cảm quan: Bằng thị giác, vị giác, khứu giác.
- Xác định độ ẩm: Bằng phương pháp cất với dung môi (Tiến hành theo phụ lục 12.13 DĐVN IV)
- Đo pH: Cao đặc được pha loãng thành dung dịch 1% (kl/tt). Đo pH bằng máy đo pH.
- Xác định chất chiết được bằng nước: Bằng phương pháp chiết lạnh (Tiến hành theo phụ lục 12.10 DĐVN IV)
Công thức tính:
Trong đó: C: Hàm lượng chất chiết được bằng nước của cao (%) m2: Tổng khối lượng cốc và cắn (g)
m1: Khối lượng cốc (g)
m: Khối lượng cao đem thử (g) H: Hàm ẩm của cao (%)
- Xác định tỷ lệ tro toàn phần: Tiến hành theo phụ lục 9.8 DĐVN IV. Công thức tính:
Trong đó: m: Khối lượng chén nung (g) m1: Khối lượng cao (g)
m2: Tổng khối lượng chén nung và tro sau khi nung (g) H: Độ ẩm cao đặc (%)
2.3.3.2. Định tính các nhóm chất hữu cơ:
Phương pháp hóa thực vật thường quy
Căn cứ các nhóm chất hóa học có trong các vị thuốc của bài thuốc để định hướng định tính. Tiến hành phản ứng với các thuốc thử chung và thuốc thử đặc hiệu của từng nhóm chất [3], [4], [5], [16].
2.3.3.3. Kiểm tra các vị thuốc trong cao đặc bằng SKLM:
Chuẩn bị dịch chấm sắc ký, bản mỏng, dung môi khai triển; thể tích chấm sắc kí của vị thuốc và cao đặc là như nhau, tất cả tiến hành trong cùng điều kiện. So sánh các vết trên sắc ký đồ của vị thuốc và cao đặc. Nếu trong sắc ký đồ của cao đặc có các vết tương đương với vết trong sắc ký đồ của vị thuốc cả về màu sắc và Rf thì có thể sơ bộ xác định trong cao đặc có chứa vị thuốc đó [3], [4], [5], [10].
2.3.4. Dự kiến tiêu chuẩn cao đặc
+ Yêu cầu chất lượng: Dựa vào kết quả khảo sát cao đặc
+ Phương pháp đánh giá (phương pháp thử): Theo các phương pháp đã khảo sát.
2.3.5. Thử tác dụng chống viêm cấp
- Phương pháp: mô hình gây viêm ở tai chuột nhắt trắng bởi dầu croton được tiến hành dựa theo mô hình do Tubaro và cộng sự đã đưa ra (1985).
Hoạt chất chính của dầu croton là chất hữu cơ được gọi là phorbol. Cơ chế gây kích ứng da của dầu croton được giải thích thông qua Phospholipase A2 (PLA2). Dầu croton làm tăng hoạt tính của PLA2 dẫn tới tăng tạo acid arachidonic và sau đó là các yếu tố liên quan tới quá trình viêm như leucotrien và prostaglandin. Cơ chế gây kích ứng da của dầu croton có sự tham gia hoạt hóa của hai hệ enzym là Cyclooxygenase (COX) và Lipooxigenase (LOX) [19], [24]. Mô hình này đã được nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới sử dụng để đánh giá tác dụng chống viêm của các thuốc hoặc dược chất [27], [32].
Tác nhân gây phù tai chuột là dầu croton pha trong aceton.
Gây mô hình: Mặt ngoài của tai chuột được bôi 20 µl dung dịch dầu croton (trong aceton) để gây mô hình viêm tai, tiến hành việc bôi dung dịch dầu croton bằng pipet. Chỉ bôi tai phải, tai trái không bôi để đối chiếu.
Methylprednisolon đường uống được dùng làm thuốc đối chứng dương trong nghiên cứu này. Corticoid đã được chứng minh là có tác dụng mạnh nhất trên mô hình viêm cấp bằng dầu croton [31].
Thí nghiệm được tiến hành trên 3 lô chuột nhắt: Lô mô hình, lô thử thuốc chuẩn (methylprednisolone) và lô thử cao thuốc.
Xác định mức độ ức chế viêm ở tai chuột để đánh giá tác dụng chống viêm của cao đặc bài thuốc.
- Chỉ tiêu quan sát: chênh lệch độ dày, trọng lượng tai
- Chỉ tiêu đánh giá: mức độ ức chế viêm giữa các lô. Tính theo công thức:
- Xử lý số liệu:
Số liệu được nhập bằng phần mềm Excel 2007 – Microsolf, xử lý bằng phần mềm SPSS 16.0. Số liệu được biểu diễn dưới dạng SD. Kiểm định các giá trị bằng test t – Student, test t ghép cặp, test ANOVA 2 chiều.
Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 3.1. Kiểm tra chất lượng các vị thuốc
Sơ chế: Các vị thuốc sau khi mua về được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ 60oC, nghiền thành bột mịn, bột thô để kiểm tra theo tiêu chuẩn DĐVN IV.