Chuẩn bị dịch chấm sắc ký, bản mỏng, dung môi khai triển; thể tích chấm sắc kí của vị thuốc và cao đặc là như nhau, tất cả tiến hành trong cùng điều kiện. So sánh các vết trên sắc ký đồ của vị thuốc và cao đặc. Nếu trong sắc ký đồ của cao đặc có các vết tương đương với vết trong sắc ký đồ của vị thuốc cả về màu sắc và Rf thì có thể sơ bộ xác định trong cao đặc có chứa vị thuốc đó [3], [4], [5], [10].
2.3.4. Dự kiến tiêu chuẩn cao đặc
+ Yêu cầu chất lượng: Dựa vào kết quả khảo sát cao đặc
+ Phương pháp đánh giá (phương pháp thử): Theo các phương pháp đã khảo sát.
2.3.5. Thử tác dụng chống viêm cấp
- Phương pháp: mô hình gây viêm ở tai chuột nhắt trắng bởi dầu croton được tiến hành dựa theo mô hình do Tubaro và cộng sự đã đưa ra (1985).
Hoạt chất chính của dầu croton là chất hữu cơ được gọi là phorbol. Cơ chế gây kích ứng da của dầu croton được giải thích thông qua Phospholipase A2 (PLA2). Dầu croton làm tăng hoạt tính của PLA2 dẫn tới tăng tạo acid arachidonic và sau đó là các yếu tố liên quan tới quá trình viêm như leucotrien và prostaglandin. Cơ chế gây kích ứng da của dầu croton có sự tham gia hoạt hóa của hai hệ enzym là Cyclooxygenase (COX) và Lipooxigenase (LOX) [19], [24]. Mô hình này đã được nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới sử dụng để đánh giá tác dụng chống viêm của các thuốc hoặc dược chất [27], [32].
Tác nhân gây phù tai chuột là dầu croton pha trong aceton.
Gây mô hình: Mặt ngoài của tai chuột được bôi 20 µl dung dịch dầu croton (trong aceton) để gây mô hình viêm tai, tiến hành việc bôi dung dịch dầu croton bằng pipet. Chỉ bôi tai phải, tai trái không bôi để đối chiếu.
Methylprednisolon đường uống được dùng làm thuốc đối chứng dương trong nghiên cứu này. Corticoid đã được chứng minh là có tác dụng mạnh nhất trên mô hình viêm cấp bằng dầu croton [31].
Thí nghiệm được tiến hành trên 3 lô chuột nhắt: Lô mô hình, lô thử thuốc chuẩn (methylprednisolone) và lô thử cao thuốc.
Xác định mức độ ức chế viêm ở tai chuột để đánh giá tác dụng chống viêm của cao đặc bài thuốc.
- Chỉ tiêu quan sát: chênh lệch độ dày, trọng lượng tai
- Chỉ tiêu đánh giá: mức độ ức chế viêm giữa các lô. Tính theo công thức:
- Xử lý số liệu:
Số liệu được nhập bằng phần mềm Excel 2007 – Microsolf, xử lý bằng phần mềm SPSS 16.0. Số liệu được biểu diễn dưới dạng SD. Kiểm định các giá trị bằng test t – Student, test t ghép cặp, test ANOVA 2 chiều.
Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 3.1. Kiểm tra chất lượng các vị thuốc
Sơ chế: Các vị thuốc sau khi mua về được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ 60oC, nghiền thành bột mịn, bột thô để kiểm tra theo tiêu chuẩn DĐVN IV.
3.1.1. Núc nác 3.1.1.1. Mô tả: 3.1.1.1. Mô tả:
Vỏ cuộn lại thành hình ống hay hình cung, dày 0,6 - 1,3 cm, dài ngắn không nhất định. Mặt ngoài màu vàng nâu nhạt, nhăn nheo, có nhiều đường vân dọc, ngang. Mặt trong nhẵn, màu vàng xám hay vàng lục. Mặt bẻ ngang có lớp bần mỏng. Mô mềm vỏ lổn nhổn như có nhiều sạn, trong cùng có lớp sợi dễ tách theo chiều dọc. Trên thị trường bán dạng thuốc phiến, phiến dày 1 – 2cm, dài 4 – 5cm, hình cung (Hình 3.1).
3.1.1.2. Soi bột:
Tiến hành: Lấy 1 lượng bột nhỏ đã nghiền mịn, cho vào 1 giọt nước đã có sẵn trên lam kính, đậy lam kính, quan sát dưới kính hiển vi.
Bột có những đặc điểm sau: nhiều sợi dài, màu vàng nhạt, thành dày, khoang rộng. Tế bào mô cứng màu vàng, hình nhiều cạnh, thành hơi dày, khoang rộng. Rất nhiều tinh thể calci oxalat hình kim, 2 đầu thuôn nhọn hoặc vuông. Mảnh mô mềm hình đa giác, thường chứa tinh thể calci oxalat hình kim.
Các đặc điểm được thể hiện ở hình 3.2:
Hình 3.1. Ảnh thuốc phiến Núc nác Hình 3.2. Ảnh đặc điểm bột núc nác Ghi chú: 1. Tế bào mô cứng; 2. Sợi; 3. Mảnh mô mềm; 4. Tinh thể calci oxalate.
Nhận xét: Các đặc điểm của bột Núc nác phù hợp với tiêu chuẩn DĐVN IV.
3.1.1.3. Định tính bằng phản ứng hóa học:
Tiến hành:
Lấy 0,5 g bột thô dược liệu vào ống nghiệm, thêm 5 ml ethanol (TT), lắc. Đun cách thuỷ 5 - 10 phút, lọc. Lấy dịch lọc cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml, làm các phản ứng sau:
Ống 1: Thêm 3 giọt acid hydrocloric (TT), thêm một ít bột magnesi (TT) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ống 2: Thêm 1 giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% (TT)
Ống 3: Thêm từ từ theo thành ống 5 ml 0,5 ml acid sulfuric (TT) Kết quả:
Ống 1: Phản ứng dương tính. Dung dịch có màu vàng cam (phù hợp với tiêu chuẩn DĐVN IV).
Ống 2: Phản ứng dương tính. Dung dịch có màu xanh đen (phù hợp với tiêu chuẩn DĐVN IV).
Ống 3: Phản ứng dương tính. Dung dịch phân lớp, phía dưới có màu nâu, để yên màu nâu càng rõ (phù hợp với tiêu chuẩn DĐVN IV).
Nhận xét: Các phản ứng phù hợp với DĐVN IV.
3.1.1.4. Độ ẩm:
Tiến hành:
- Chuẩn bị 1 cốc thủy tinh, rửa sạch, sấy ở 100oC trong 30 phút, cân khối lượng cốc. - Cân vào cốc chính xác 1,00g bột núc nác, dàn mỏng.
- Sấy ở 105oC trong 4 giờ.
- Lấy ra cho vào bình hút ẩm 30 phút. - Cân xác định khối lượng.
Làm 3 lần lấy kết quả trung bình.
Yêu cầu: độ ẩm không quá 14%
Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm núc nác. Mẫu m m1 m2 Độ ẩm (%) 1 54,3877 1,0235 55,2993 10,93 2 51,3355 1,0715 52,2718 12,62 3 53,0427 0,9724 53,8907 12,79 TB 12,11
Nhận xét: Độ ẩm của Núc nác đạt tiêu chuẩn DĐVN IV.
3.1.1.5. Chất chiết được trong dược liệu:
Xác định chất chiết được trong ethanol bằng phương pháp chiết hồi lưu.
Tiến hành:
- Cân chính xác khoảng 2,000g bột dược liệu có cỡ bột nửa thô cho vào bình nón 100 ml. Thêm chính xác 50,0 ethanol 96%, đậy kín, cân xác định khối lượng, để yên 1 giờ.
- Đun sôi nhẹ dưới hồi lưu 1 giờ, để nguội, lấy bình nón ra, đậy kín, cân để xác định lại khối lượng, dùng ethanol 96% để bổ sung phần khối lượng bị giảm.
- Lọc qua phễu lọc khô vào một bình hứng khô thích hợp, lấy chính xác 25 ml dịch lọc vào cốc thủy tinh đã cân bì trước, cô trong cách thủy đến cắn khô.
- Cắn thu được sấy ở 105 0C trong 3 giờ, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30 phút. - Cân xác định khối lượng cắn.
- Tính phần trăm lượng chất chiết được bằng nước theo dược liệu khô. Yêu cầu: không được ít hơn 10,0% tính theo dược liệu khô kiệt.
Kết quả: ghi ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hàm lượng chất chiết được bằng ethanol của núc nác.
Mẫu m m1 m2 C (%)
1 2,0584 56,7546 56,9058 16,72
2 2,0165 60,2315 60,3719 15,84
3 2,0017 42,9435 43,0879 16,42
TB 16,33 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhận xét chung: Từ các đặc điểm đã kiểm tra ở trên, về cơ bản có thể xác định vị thuốc núc nác đạt tiêu chuẩn DĐVN IV.
3.1.2. Kim ngân hoa 3.1.2.1. Mô tả: 3.1.2.1. Mô tả:
Nụ hoa hình ống hơi cong queo, dài 1 – 5 cm, đầu to, đường kính khoảng 0,2 – 0,5 cm. Mặt ngoài màu vàng đến nâu, phủ đầy lông ngắn. Phía dưới ống tràng có 5 lá đài nhỏ, màu lục. Mùi thơm nhẹ, vị hơi đắng. Hoa đã nở dài từ 2 – 5 cm, tràng chia thành 2 môi cuộn ngược lại. Nhị và vòi nhụy thường thò ra ngoài tràng hoa. Hình ảnh vị thuốc Kim ngân hoa (Hình 3.3)
3.1.2.2. Soi bột:
Tiến hành: tương tự như soi bột núc nác (Mục 3.1.1.2 trang 27).
Bột có những đặc điểm sau: Bột màu vàng nâu nhạt, có mùi thơm nhẹ, vị hơi đắng. Soi kính hiển vi thấy: hạt phấn hình cầu, màu vàng, có 3 lỗ rãnh nảy mầm rõ, bề mặt có nhiều gai nhỏ, thưa. Lông che chở đơn bào thành dầy, nhẵn hoặc có những chấm lồi nhỏ. Mảnh biểu bì cánh hoa mang lông che chở. Mảnh cánh hoa mang các bó mạch xếp song song.
Các đặc điểm được thể hiện ở hình 3.4.
Hình 3.3. Ảnh vị thuốc Kim ngân hoa Hình 3.4. Đặc điểm bột Kim ngân hoa
Ghi chú: 1. Mảnh biểu bì mang lông che chở; 2. Mảnh biểu bì; 3. Mảnh cánh hoa; 4. Mảnh cánh hoa mang bó mạch; 5,6. Lông che chở; 7. Hạt phấn.
3.1.2.3. Định tính bằng các phản ứng hóa học:
Phản ứng 1:
Tiến hành: Lấy 5 g bột dược liệu cho vào bình nón có dung tích 100 ml, thêm 20 ml ethanol 90%(TT). Lắc kỹ, đun cách thủy trong 15 phút, lọc. Cô dịch lọc trên cách thủy đến khi còn khoảng 5 ml. Lấy 1 ml dung dịch vào ống nghiệm, thêm 2 - 3 giọt dung dịchacid HCl (TT) và một ít bột magnesi(TT).
Kết quả: Phản ứng dương tính. Dung dịch chuyển từ màu vàng sang cam đỏ (phù hợp tiêu chuẩn DĐVN IV).
Phản ứng 2:
Tiến hành: Lấy 1 g bột dược liệu cho vào ống nghiệm, thêm 10 ml nước cất, lắc nhẹ trong 5 phút, lọc. Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml dịch lọc. Thêm 2 – 3 giọt dung dịchnatri hydroxyd 10%(TT) vào ống nghiệm thứ nhất.
Kết quả: Phản ứng dương tính. Dung dịch có màu vàng đậm hơn ống nghiệm không thêm dung dịch NaOH 10% (TT) (phù hợp tiêu chuẩn DĐVN IV).
Nhận xét: Các phản ứng phù hợp với DĐVN IV.
3.1.2.4. Độ ẩm:
Tiến hành: Tương tự như xác định độ ẩm núc nác (Mục 3.1.1.4 trang 28). Sử dụng 1,00g bột Kim ngân hoa, sấy ở 85oC trong 4 giờ.
Yêu cầu: độ ẩm không quá 12%
Kết quả: ghi ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả xác định độ ẩm kim ngân hoa.
Mẫu m m1 m2 Độ ẩm (%)
1 50,0995 0,9912 50,9840 10,76
2 52,2392 1,0321 53,1585 10,93
3 56,3075 1,0408 57,2397 10,43
TB 10,71
Nhận xét: Độ ẩm của Kim ngân hoa đạt tiêu chuẩn DĐVN IV
3.1.2.5. Chất chiết được trong dược liệu:
Sử dụng ethanol 90% làm dung môi. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Yêu cầu: Không được ít hơn 29,0%, tính theo dược liệu khô kiệt.
Kết quả: ghi ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Hàm lượng chất chiết được bằng ethanol của kim ngân hoa.
Mẫu m m1 m2 C (%)
1 2,1272 51,9848 52,4570 49,72
2 2,0299 57,0050 57,4535 49,49
3 2,0175 50,0697 50,5204 50,04
TB 49,75
Nhận xét: Hàm lượng chất chiết được trong Kim ngân hoa đạt tiêu chuẩn DĐVN IV Nhận xét chung: Từ các đặc điểm đã kiểm tra ở trên, về cơ bản có thể xác định vị thuốc kim ngân hoa đạt tiêu chuẩn DĐVN IV.
3.1.3. Đơn lá đỏ 3.1.3.1. Mô tả: 3.1.3.1. Mô tả:
Lá hình bầu dục hai đầu thuôn nhọn, dài 6 – 12 cm, rộng 2 – 4 cm. Cuống lá dài 0,5 – 1 cm. Phiến lá nguyên, mặt trên lá màu lục sẫm, mặt dưới màu đỏ tía. Có 10 – 12 cặp gân lông chim nổi rõ ở mặt dưới lá, lõm ở mặt trên lá.
Hình ảnh vị thuốc Đơn lá đỏ (Hình 3.5)
3.1.3.2. Soi bột:
Tiến hành: Tương tự như soi bột núc nác (Mục 3.1.1.2 trang 27).
Bột có những đặc điểm sau: Bột lá có màu xanh nâu, mùi hắc nhẹ. Quan sát dưới kính hiển vi cho thấy có: mảnh mô mềm chứa chất màu, mạch mạng, mạch xoắn, tinh thể calci oxalat.
Hình 3.5. Ảnh vị thuốc Đơn lá đỏ Hình 3.6. Ảnh đặc điểm bột Đơn lá đỏ
Ghi chú: 1,2. Mảnh mô mềm; 3,4. Mảnh mạch; 5. Tinh thể calci oxalat.
Nhận xét: Các đặc điểm bột của Đơn lá đỏ phù hợp với tiêu chuẩn DĐVN IV
3.1.3.3. Định tính bằng các phản ứng hóa học:
Phản ứng 1:
Tiến hành: Cân 1 g bột dược liệu cho vào ống nghiệm, thêm 5 ml ethanol 50% (TT), đun cách thủy trong 5 phút, lọc.
Kết quả: Phản ứng dương tính. Dịch lọc có màu đỏ tía (phù hợp với tiêu chuẩn DĐVN IV).
Phản ứng 2:
Tiến hành: Cân 5g bột dược liệu cho vào bình Soxhlet, chiết với ether dầu hỏa (30 – 60OC) (TT) đến hết màu. Bã dược liệu để bay hơi hết dung môi, thêm 50 ml
ethanol 90% (TT), đun hồi lưu cách thủy trong 30 phút, lọc. Dịch lọc cô còn khoảng 3ml. Lấy 1 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm một ít bột magnesi (TT) và vài giọt HCl (TT), đun nóng nhẹ trên bếp cách thủy.
Kết quả: Phản ứng dương tính. Xuất hiện màu hồng đỏ (phù hợp với DĐVN IV).
Nhận xét: Các phản ứng phù hợp với DĐVN IV.
3.1.3.4. Độ ẩm:
Tiến hành:
Bão hòa nước vào dung môi toluene: Rửa sạch ống hứng và ống sinh hàn với nước rồi làm khô. Thêm 200 ml toluen (TT) và khoảng 2 ml nước vào bình cầu khô. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cất khoảng 2 giờ, để nguội trong 30 phút, đến khi lớp nước và lớp toluen đã được phân tách hoàn toàn đọc thể tích nước ở ống hứng (V1)
Xác định độ ẩm dược liệu: Thêm vào bình cầu một lượng bột đơn lá đỏ đã cân chính xác tới 0,01 g có chứa khoảng 2 - 3 ml nước. Tiếp tục cất dung môi đến khi cột nước ở ống hứng không tăng lên nữa sau 30 phút. Nếu có những giọt nước còn đọng trên thành ống sinh hàn thì dùng 5 ml toluen để rửa kéo xuống. Để nguội, đọc thể tích nước (V2). Tính tỷ lệ phần trăm nước trong mẫu thử.
Làm 3 lần lấy kết quả trung bình.
Yêu cầu: Không quá 13%
Kết quả: ghi ở bảng 3.5. Bảng 3.5. Kết quả xác định độ ẩm đơn lá đỏ. Mẫu m V1 V2 H (%) 1 6,9438 2,70 3,50 11,52 2 7,5069 3,50 4,40 11,99 3 8,0064 4,40 5,30 11,24 TB 11,58
Nhận xét: Độ ẩm của Đơn lá đỏ đạt tiêu chuẩn DĐVN IV
Nhận xét chung: Từ các đặc điểm đã kiểm tra ở trên, về cơ bản có thể xác định vị thuốc đơn lá đỏ đạt tiêu chuẩn DĐVN IV.
3.1.4. Trần bì 3.1.4.1. Mô tả:
Vỏ cuốn lại hoặc quăn, dày 0,1 – 0,15 cm. Mặt ngoài màu vàng nâu hay nâu nhạt, có nhiều chấm màu sẫm hơn và lõm xuống (túi tiết). Mặt trong xốp, màu trắng ngà hoặc hồng nhạt, thường lộn ra ngoài. Vỏ nhẹ, giòn, dễ bẻ gãy. Mùi thơm, vị hơi đắng, hơi cay.
Trên thị trường bán dạng thuốc phiến, phiến dày 1 – 2mm, dài 3 – 4cm, quăn lại (hình 3.7).
3.1.4.2. Soi bột:
Bột có các đặc điểm sau: Tế bào vỏ quả ngoài hình nhiều cạnh, màu vàng nhạt, thành hơi dày. Mảnh mô mềm vỏ quả giữa gồm những tế bào thành mỏng, hình chữ nhật. Mảnh mạch vòng, mạch xoắn. Tinh thể calci oxalat hình khối.
Các đặc điểm được thể hiện ở hình 3.8.
Hình 3.7. Ảnh thuốc phiến Trần bì Hình 3.8. Ảnh đặc điểm bột Trần bì
Nhận xét: Các đặc điểm của bột Trần bì phù hợp với tiêu chuẩn DĐVN IV.
3.1.4.3. Định tính bằng phương pháp hóa học:
Tiến hành:
Cho 2 g bột dược liệu vào 1 bình nón 100 ml, thêm 10 ml ethanol 96% (TT), đun sôi hồi lưu cách thủy trong 10 phút. Lọc lấy dịch lọc, chia làm các ống nghiệm: Ống 1: Lấy 2 ml dịch lọc, thêm một ít bột magnesi (TT), 10 giọt HCl (TT)
Ống 2: Lấy 2 ml dịch lọc, thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% (TT)
Ống 3: Lấy 2 ml dịch lọc, thêm vài giọt dung dịch natri hydroxyd 5% (TT) Kết quả:
Ống 1: Phản ứng dương tính. Xuất hiện màu đỏ sau vài phút (phù hợp với tiêu chuẩn DĐVN IV)
Ống 2: Phản ứng dương tính. Thấy xuất hiện màu xanh đen (phù hợp với tiêu chuẩn DĐVN IV).
Ống 3: Phản ứng dương tính. Thấy xuất hiện màu vàng cam kèm theo một ít tủa (phù hợp với tiêu chuẩn DĐVN IV).
Ghi chú: 1. Mảnh mạch; 2. Tinh thể Calci oxalate; 3. Mảnh biểu bì vỏ quả; 4. Mảnh mô mềm.
Nhận xét: Các phản ứng phù hợp với tiêu chuẩn DĐVN IV.
3.1.4.4. Độ ẩm:
Tiến hành: tương tự như đo độ ẩm đơn lá đỏ (Mục 3.1.3.4 trang 33 - 34). Yêu cầu: Không quá 13%
Kết quả: ghi ở bảng 3.6. Bảng 3.6. Kết quả xác định độ ẩm trần bì. Mẫu m V1 V2 H (%) 1 7,0221 2,40 2,80 5,70 2 8,0230 2,80 3,30 6,23 3 9,0137 3,30 3,90 6,66 TB 6,20
Nhận xét: Độ ẩm của Trần bì đạt tiêu chuẩn DĐVN IV
Nhận xét chung: Từ các đặc điểm đã kiểm tra ở trên, về cơ bản có thể xác định vị thuốc trần bì đạt tiêu chuẩn DĐVN IV (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});