Phân lập bằng SKLM với chất hấp phụ là Silicagel GF254.
- Dịch Ethyl acetat được chấm thành các vết liên tục lên bản mòng Silicagel. - Dung môi khai triển: n-hexan : ethyl acetat : acid formic (20 : 15 : 1). - Hiện màu: Ánh sáng tử ngoại λ = 254 nm có vết rõ, đậm và lớn nhất. - Dùng thước đánh dấu vị trí vết rõ, đậm và lớn nhất, cạo lấy lớp silicagel. - Phản hấp phụ bằng ethyl acetat (4 lần x 20 ml). Lọc.
- Bay hơi tự nhiên, tinh thể kết tinh màu vàng nhạt (hình 3.3).
Hình 3.3. Chất HL65 thu được
Kiểm tra chất HL65 phân lập được bằng SKLM
- Lấy khoảng 1 mg cắn, hòa tan trong khoảng 1 ml ethanol tuyệt đối. - Khai triển trên SKLM với các hệ dung môi khác nhau.
Hệ 1: Toluen : ethyl acetat : acid formic (3 : 2 :1) Hệ 2: n-butanol : acid acetic : nước (4 :1 :5) Hệ 3: Ethyl acetat : methanol (6:1)
- Kết quả sắc ký đồ quan sát tại bước sóng 254 nm và ánh sáng thường sau khi hiện màu bằng hơi amoniac của 3 hệ dung môi được thể hiện ở hình 3.4 và hình 3.5.
Hệ 1 Hệ 2 Hệ 3 Hệ 1 Hệ 2 Hệ 3
Chú thích: Hệ 1: Toluen : ethyl acetat : acid formic (3 : 2 :1) Hệ 2: n-butanol : acid acetic : nước (4 :1 :5)
Hệ 3: Ethyl acetat : methanol (6:1)
Nhận xét:
Từ hình 3.4 và hình 3.5 cho thấy :
Sắc ký đồ với 3 hệ dung môi đều cho 1 vết với Rf tương ứng là 0.41; 0.86 và 0.81. Như vậy có thể sơ bộ cho rằng chất HL65 là tinh khiết.
Chất HL65 thu được ở dạng tinh thể, hình que, màu vàng nhạt.
Quan sát chất HL65 bằng kính hiển vi ở vật kính 10 (hình 3.6).
Hình 3.6. Tinh thể chất HL65 khi soi ở vật kính 10
Hình 3.4. Sắc ký đồ chất HL65 quan sát tại UV 254nm
Hình 3.5. Sắc ký đồ chất HL65 ở ánh sáng thường- hiện màu hơi NH3