3.2.1.1. Định tính Alcaloid
Lấy 5 g cao dược liệu, hòa trong 15 ml nước. Lọc. Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N đến pH 9-10. Chiết alcaloid base bằng cloroform (chiết 3 lần, mỗi lần 5 ml). Gộp các dịch chiết cloroform, loại nước bằng natri sulfat khan. Dịch chiết đem lắc với acid sulfuric 1N hai lần, mỗi lần 5 ml. Gộp các dịch chiết nước chia đều vào ống nghiệm nhỏ. Nhỏ vào từng ống nghiệm 2-3 giọt lần lượt các thuốc thử:
Ống 1: thuốc thử Mayer Ống 2: thuốc thử Dragendorff Ống 3: thuốc thử Bouchardat.
Dịch chiết trong các ống nghiệm trong suốt. Phản ứng âm tính (-). Đánh giá: Trong cao lá Phèn đen không có alcaloid.
3.2.1.2. Định tính Anthranoid
Phản ứng Borntraeger: Định tính anthranoid toàn phần
Lấy 3 g cao dược liệu hòa trong 15 ml nước. Lọc. Lấy dịch lọc, thêm 5 ml chloroform, lắc nhẹ. Gạn bỏ lớp nước. Giữ lớp chloroform để làm phản ứng.
Lấy 1 ml dịch chiết chloroform, cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1 ml dung dịch NaOH 10%. Lắc nhẹ.
Lớp nước không xuất hiện màu đỏ. Phản ứng âm tính (-) Đánh giá: Trong cao dược liệu không có Anthranoid.
3.2.1.3. Định tính Glycosid tim
Lấy 5 g cao dược liệu hòa trong 30 ml nước. Lọc. Thêm vào dịch lọc 3ml chì acetat 30%, khuấy đều. Lọc qua giấy lọc gấp nếp vào một cốc có mỏ dung tích 100ml. Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat. Xuất hiện tủa trắng, ngừng lọc, thêm khoảng 1ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại, và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat. Chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình gạn. Lắc kỹ 2 lần với hỗn hợp Chloroform: Ethanol (4:1), mỗi lần với 5ml. Gạn dịch chiết Chloroform vào cốc có mỏ, loại nước bằng natri sulfat khan. Chia đều dịch chiết vào 3 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô và bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô. Cắn thu được đem tiến hành các phản ứng sau:
Phản ứng của khung Steroid:
Phản ứng Liebermann- Bourchardat: Cho vào ống nghiệm chứa cắn 1 ml Anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn. Nghiêng ống 45º. Cho từ từ theo thành ống 0.5 ml H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Quan sát thấy giữa hai lớp chất lỏng thấy xuất hiện vòng màu đỏ. Phản ứng dương tính (+).
Phản ứng của vòng lacton 5 cạnh:
- Phản ứng Legal: Hòa tan cắn trong ống nghiệm bằng 0.5 ml Ethanol 90º. Nhỏ 1 giọt thuốc thử Natri nitroprussinat 0.5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10% . Lắc đều, không thấy xuất hiện màu đỏ cam. Phản ứng âm tính (-).
- Phản ứng Baljet: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0.5 ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet (gồm 1 phần dung dịch acid Picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%). Quan sát không thấy màu đỏ cam. Phản ứng âm tính (-)
Phản ứng của phần đường 2,6-desoxy:
- Phản ứng Keller- Kiliani: Hòa tan cắn bằng 0.5 ml Ethanol 90o. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ vài giọt dung dịch FeCl3 5% trong acid acetic, lắc đều. Nghiêng ống nghiệm 45o
cho từ từ theo thành ống 0.5 ml H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Ở giữa hai lớp chất lỏng có vòng màu đỏ. Phản ứng dương tính (+).
Đánh giá: Trong cao dược liệu không chứa glycosid tim.
3.2.1.4. Định tính Flavonoid
Lấy 3 g cao dược liệu, hòa trong 10 ml nước. Loại tạp với 5 ml cloroform. Lắc dịch nước với ethyl acetat (3 lần x 5 ml). Gạn lấy lớp ethyl acetat. Gộp các dịch ethyl acetat cô đến cắn. Hòa tan cắn trong ethanol 70o, lấy dịch làm định tính.
Phản ứng Cyanidin: Cho 1ml dịch chiết cồn, thêm một ít bột Magie kim loại. Nhỏ từng giọt HCl đặc (3-5 giọt). Để yên một vài phút, dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ. Phản ứng dương tính (+).
Phản ứng với kiềm:
- Phản ứng với NH3: Nhỏ 1-2 giọt dịch chiết cồn. Hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nút, thấy màu vàng của vết dịch chiết được tăng lên. Phản ứng dương tính (+).
- Phản ứng với dd NaOH: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết cồn. Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% thấy xuất hiện tủa vàng. Thêm 1 ml nước cất thấy tủa tan và màu vàng của dung dịch tăng lên. Phản ứng dương tính (+).
Phản ứng với dd FeCl3 5%: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết cồn. Thêm vào 2-3 giọt dd FeCl3 5% thấy xuất hiện tủa xanh đen. Phản ứng dương tính (+).
Đánh giá: Trong cao dược liệu có Flavonoid.
3.2.1.5. Định tính Courmarin
Lấy 3 g cao dược liệu hòa trong 10 ml ethanol 90%. Ly tâm 5 phút. Lọc lấy dịch làm phản ứng.
Phản ứng mở, đóng vòng lacton (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dịch chiết cồn. Ống 1: thêm 0.5 ml dung dịch NaOH 10%
Ống 2: để nguyên
Đun cả 2 ống đến sôi, để nguội, quan sát thấy dịch ở ống 1 và ống 2 đều hơi vàng như nhau, trong. Phản ứng âm tính (-).
Quan sát hiện tượng huỳnh quang
Nhỏ 2-3 giọt dịch trong lên một khoanh giấy lọc. Nhỏ 2-3 giọt dung dịch NaOH 5% lên vị trí có dịch chiết. Sấy nhẹ. Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một miếng kim loại, chiếu tia tử ngoại trong một vài phút. Bỏ miếng kim loại ra, quan sát dưới đèn tử ngoại thấy phần không bị che có huỳnh quang như phần bị che. Phản ứng âm tính (-).
Đánh giá: Trong cao không chứa Coumarin.
3.2.1.6. Định tính saponin
- Quan sát hiện tượng tạo bọt
Cho vào ống nghiệm 0.5 g cao dược liệu thêm 5 ml nước cất. Lắc mạnh trong 5 phút theo chiều dọc của ống nghiệm, để yên, quan sát cột bọt thấy bọt ít, không bền trong 15 phút. Phản ứng âm tính (-).
Đánh giá: Trong cao dược liệu không chứa saponin.
Hòa tan 5 g cao dƣợc liệu trong 20 ml nƣớc. Tẩy màu bằng than hoạt (khoảng 2 g). Lọc lấy dịch làm phản ứng định tính tanin, acid hữu cơ, acid amin, đƣờng khử, polysaccharid.
3.2.1.7. Định tính tanin
Cho vào 4 ống nghiệm, mỗi ống 1ml dịch nước, làm các phản ứng sau:
- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho vào ống nghiệm chứa dịch chiết nước 2-3 giọt FeCl3 5% xuất hiện kết tủa màu xanh đen. Phản ứng dương tính (+).
- Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: thêm 2-3 giọt dung dịch gelatin 1% vào ống nghiệm chứa dịch chiết nước thấy tủa bông trắng. Phản ứng dương tính (+).
- Phản ứng với dung dịch chì acetat: cho vào ống nghiệm chứa dịch chiết nước 2-3 giọt dung dịch chì acetat 10% thấy tủa bông trắng. Phản ứng dương tính (+).
Đánh giá: Trong cao dược liệu chứa tanin
3.2.1.8. Định tính Acid hữu cơ
Cho vào ống nghiệm có dịch chiết nước một ít tinh thể Na2CO3, quan sát không thấy có bọt khí. Phản ứng âm tính (-).
Đánh giá: Trong cao dược liệu không chứa Acid hữu cơ.
3.2.1.9. Định tính Acid amin
Lấy 2 ml dịch chiết nước vào ống nghiệm sạch, thêm vào 2-3 giọt thuốc thử Ninhydrin 3%, đun cách thủy sôi 10 phút không thấy chuyển sang màu tím. Phản ứng âm tính (-).
Đánh giá: Trong cao dược liệu không có chứa Acid amin.
3.2.1.10. Định tính đường khử
Lấy 2 ml dịch chiết nước, thêm 3 giọt thuốc thử Fehling A và B, đun cách thủy 10 phút thấy có tủa đỏ gạch. Phản ứng dương tính (+).
Đánh giá: Cao dược liệu có đường khử.
3.2.1.11. Định tính Polysaccharid
Lấy 2 ống nghiệm sạch cho vào mỗi ống:
Ống 1: 4 ml nước cất và 5 giọt thuốc thử Lugol.
Ống 2: 4 ml dịch chiết nước và 5 giọt thuốc thử Lugol. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Quan sát thấy màu 2 ống không đậm hơn màu ống 1. Phản ứng âm tính (-). Đánh giá: Trong cao dược liệu không có polysaccharid.
Tiến hành chiết xuất dịch chiết ether dầu hỏa từ cao dƣợc liệu để làm các phản ứng định tính sterol, chất béo, caroten nhƣ sau:
- Cân 5 g cao dược liệu hòa trong 20 ml nước. Lọc.
- Lấy dịch lọc lắc với ether dầu hỏa (3 lần x 8 ml). Gạn lấy lớp dịch ether đem làm phản ứng.
3.2.1.12. Định tính chất béo
Nhỏ 2 giọt dịch chiết ether dầu hỏa lên giấy lọc, hơ nóng cho bay hơi hết dung môi. Quan sát không thấy để lại vết mờ trên giấy lọc. Phản ứng âm tính (-).
Đánh giá: Cao dược liệu không chứa chất béo.
3.2.1.13.Định tính Sterol
Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết ether dầu hỏa, bốc hơi dung môi đến khô. Thêm vào ống nghiệm 1ml Anhydrid acetic, lắc kỹ. Để nghiêng 45º, nhỏ từ từ acid
sulfuric đặc theo thành ống nghiệm thấy xuất hiện vòng màu đỏ ở mặt phân cách . Phản ứng dương tính (+).
Đánh giá: Trong cao dược liệu chứa Sterol.
3.2.1.14. Định tính caroten
Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết ether dầu hỏa, bốc hơi cách thủy đến cắn. Thêm 2 giọt H2SO4 đặc vào cắn, không thấy xuất hiện màù xanh. Phản ứng âm tính (-).
Đánh giá: Trong cao dược liệu không có Caroten.
Kết quả định tính các nhóm chất trong cao dược liệu được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Tóm tắt kết quả định tính các nhóm chất trong cao lá Phèn đen STT Nhóm chất Tên phản ứng Kết quả Đánh giá
1 Alcaloid
Phản ứng với TT Mayer (-)
Không có Phản ứng với TT Dragendorff (-)
Phản ứng với TT Bouchadart (-)
2 Anthranoid Phản ứng Borntraeger (-) Không có 3 Glycosid tim Phản ứng Liebermann- Budchardt (+) Không có Phản ứng Legal (-) Phản ứng Baljet (-) Phản ứng Keller – Kiliani (+) 4 Flavonoid Phản ứng Cyanidin (+) Có Phản ứng với NH3 (+) Phản ứng với dd NaOH (+) Phản ứng với dd FeCl3 5% (+) 5 Courmarin Phản ứng mở, đóng vòng Lacton (-) Không có Quan sát huỳnh quang (-)
6 Saponin Quan sát hiện tượng tạo bọt (-) Không có
7 Tanin
Phản ứng với dd FeCl3 5% (+ )
Có Phản ứng với dd Gelatin 1% (+)
Phản ứng với dd chì acetat 10% (+)
8 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 (-) Không có 9 Acid amin Phản ứng với TT Ninhydrin (-) Không có 10 Đường khử Phản ứng với TT Fehling (+) Có 11 Polysaccharid Phản ứng với TT Lugol (-) Không có 12 Chất béo Tạo vết mờ trên giấy (-) Không có 13 Sterol Phản ứng Liebermann (+) Có 14 Caroten Phản ứng với H2SO4 đặc (-) Không có
Nhận xét:
Từ kết quả bảng 3.1 cho thấy:
Trong cao chiết nước của lá Phèn đen chứa các nhóm chất: flavonoid, tanin, đường khử, sterol. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});