Theo phương pháp của Bracco và cộng sự [47].
O NH2 OH O I I HO I 2/KI, Base (1:1) O NH2 OH O I I HO I
3.1.8.1. Tạo muối 3,5,3’-triiodo-L-thyronin dinatri:
Hòa tan 10,0 g (19,12 mmol) 3,5-diiodo-L-thyronin trong hỗn hợp gồm 70 ml nước, 62,0 ml dung dịch EtNH2 70%, hỗn hợp được làm lạnh xuống khoảng 200C. Nhỏ rất từ từ vào dung dịch trên hỗn hợp gồm 4,55 g (17,91 mmol) I2, 6,9 g (41,56 mmol) KI, 35 ml nước. Sau khi hoàn thành quá trình nhỏ, hỗn hợp được khuấy thêm 30 phút nữa và thêm vào dung dịch này 0,5 g NaHSO3. Đun nóng hỗn hợp lên khoảng 400
C, trung hòa bằng acid acetic đến pH 5-5,5, xuất hiện tủa trắng. Lọc, rửa bằng nước, sấy 600C ở áp suất giảm thu được tủa thô liothyronin base. Tủa này được tạo hỗn dịch với 60 ml EtOH, đun nóng đến khoảng 500
C. Thêm vào hỗn dịch này 6,2 ml NaOH 50%, khuấy 1h. Làm lạnh nhiệt độ phòng, lọc, sấy 600C ở áp suất giảm thu được 11,8 g tinh thể thô 3,5,3‟-triiodo-L-thyronin dinatri (hiệu suất 89,16% tính theo 3,5-diiodo-L-thyronin).
40
3.1.8.2. Tạo liothyronin mononatri:
Tạo hỗn dịch 15,0 g (21,65 mmol) 3,5,3‟-triiodo-L-thyronin dinatri thô ở trên trong 150 ml nước, điều chỉnh pH của hỗn dịch này bằng dung dịch NaOH 30% đến pH 12. Sau đó đun nóng khoảng 500
C, thêm 0,5 g natrimetabisulfit, tẩy màu bằng 1,0g than hoạt. Dịch lọc sau đó được điều chỉnh về pH 3 bằng dung dịch HCl 1M. Tủa được lọc và rửa bằng nước thu được liothyronin base. Tủa này sau đó được thêm dần vào 350 ml dung dịch Na2CO3 bão hòa ở 70-800C. Sau khi quá trình thêm hoàn thành, dung dịch được lọc nóng. Làm lạnh dần xuống 200
C xuất hiện tủa, tủa sau đó được lọc, sấy ở 400C ở áp suất giảm thu được 11,6 g liothyronin mononatri (hiệu suất 79,81% tính theo muối liothyronin dinatri).
-Xác định sơ bộ các chỉ tiêu của liothyronin mononatri tổng hợp được: - Rf= 0,31 (CHCl3:MeOH:HCOOH=70:15:15).
- Rf (T4)= 0,42(CHCl3:MeOH:HCOOH=70:15:15). - t0nc : 205-2060C.
- HPLC: hầu như không có pic lạ. [Phụ lục 10]
+ Pha động: hỗn hợp acetonitril : nước=60 : 40, thêm 0,5ml acid phosphoric trong 1000 ml.
+ Tốc độ dòng : 1,5 ml/phút.
+ Cột C18 -Phenomenex 4,6mmx25cm, 5μm, bước sóng 226 nm. [α]D = 19,30 [C=20mg/ml (hỗn hợp EtOH: dd HCl 1,2M = 4:1)].
Kết quả phân tích phổ liothyronin: IR (KBr), υ (cm-1 ): 3457,54 (NH2); 3057,83 (CHAr); 1606,02 (C=Oacid). [Phụ lục 8.1] ESI-MS (m/z): CTPT C15H12I3NO4 , tìm thấy 650,3 ([M]-). [Phụ lục 8.2] 1 H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 2,83 (1H, dd, J=8,0; 6,0 Hz, CHa); 3,11 (1H, dd, 10,5; 8,5 Hz, CHb); 3,47 (1H, t, -CH-); 6,62 (1H, dd, J=8,0; 6,0 Hz, H5‟); 6,86 (1H, d, J=9,0 Hz, H6‟); 7,01 (1H, d, J= 8,0 Hz, H2‟); 7,81 (2H, s, H2, H6). [Phụ lục 8.3]
41 13 C-NMR (125 MHz, DMSO), δ (ppm): 35,35 (CH2); 55,17 (CH); 84,56 (C3‟); 92,01 (C3, C5); 115,16 (C5‟); 116,19 (C6‟); 124,49 (C2‟); 139,19 (C2, C6); 140,83 (C1); 148,99 (C4‟); 151,87 (C1‟); 152,16 (C4); 170 (C=Oacid). [Phụ lục 8.4]
Nhận xét: Quá trình tinh chế liothyronin trải qua giai đoạn tạo muối dinatri liothyronin cho hiệu suất cao (71,16% tính từ 3,5-diiodo-L-thyronin) và chủ yếu sử dụng dung môi cồn và nước. Đây là ưu điểm nổi bật của quy trình này so với các quy trình tham khảo được.
3.1.9. Kiểm nghiệm liothyronin mononatri theo tiêu chuẩn USP 34
Mẫu liothyronin mononatri tổng hợp được, được bảo quản trong túi PE kín, được để trong lọ thủy tinh có chất hút ẩm silicagel.
Kết quả kiểm nghiệm cho thấy: Nguyên liệu liothyronin mononatri tổng hợp được đạt các tiêu chuẩn theo USP 34. [Phụ lục 11]
Bảng 3.4: Tiêu chuẩn kiểm nghiệm liothyronin mono natri theo USP 34
Chỉ tiêu Kết quả Yêu cầu
1. Mô tả Đúng Nguyên liệu dạng bột, màu nâu nhạt
2. Định tính:
- Phổ UV-VIS Đúng
- Phổ UV của dung dịch thử phải có cực đại hấp thụ giống cực đại hấp thụ của dung dịch chuẩn.
- Iod (phản ứng hóa
học) Đúng - Chế phẩm phải thể hiện phép thử định tính của iod. - Natri (phản ứng hóa
học) Đúng - Chế phẩm phải thể hiện phép thử định tính của ion natri. - Phương pháp HPLC
Đúng
- Trên sắc kí đồ, dung dịch thử phải cho pic chính có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của dung dịch liothyronin chuẩn. 3. Góc quay cực Đạt (18,50 ) +18 đến +220 tính theo chế phẩm khan (C=20mg/ml (hỗn hợp EtOH: dd HCl 1,2M = 4:1) 4. Mất khối lượng do
làm khô Đạt (2,8%) Không quá 4,0%
5. Giới hạn levothyroxin natri (Phương pháp HPLC) Đạt (1,2%) Không quá 5,0% 6. Định lượng (Phương pháp HPLC) Đạt (100,1%)
Hàm lượng liothyronin natri trong chế phẩm phải từ 95,0% đến 101,0% tính theo chế phẩm khan
42
Như vậy, chúng tôi đã xây dựng được quy trình tổng hợp liothyronin mononatri từ L-tyrosin theo sơ đồ sau:
Nguyên liệu liothyronin mononatri tổng hợp được đạt tiêu chuẩn theo USP 34.
43
Chƣơng 4. BÀN LUẬN
Như vậy, chúng tôi đã nghiên cứu tổng hợp được liothyronin mononatri từ L-tyrosin đạt tiêu chuẩn USP 34. Hiệu suất chung của cả quá trình khoảng 26,31%. Quá trình phản ứng không có sự racemic hóa. Sau đây là một số nhận xét về quá trình phản ứng và kết quả phân tích phổ của các chất trung gian và sản phẩm tổng hợp được.