n g rar ca chi Chùm Ngây ivitro ủồ
2.2.3.2. Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu được xử lý bằng chương trình Excel
Dùng phương pháp phân tích số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel 2007, các bước tiến hành như sau: mở bảng tính Excel → Data → Data analysis → Anova single
factoc hoặc Anova two factoc with replication → chọn vùng dự liệu phân tích, vùng xuất dữ liệu và độ tin cậy 0.05→ nhấn Ok.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định công thức khử trùng thích hợp cho tạo mẫu sạch in vitro
Trong quy trình kỹ thuật nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, tỷ lệ mẫu sạch có khả năng tái sinh chồi có ý nghĩa rất quan trọng đối với các bước tiếp theo. Vì vậy, cần phải tìm ra công thức khử trùng tối ưu để nâng cao hiệu quả tạo mẫu sạch in vitro và khả năng nảy mầm của mẫu sạch. Tuỳ thuộc vào loại chất khử trùng, nồng độ và thời gian khử trùng khác nhau mà hiệu quả tạo mẫu sạch in vitro thu được khác nhau. Trong nghiên cứu này, đã sử dụng hạt cây Chùm Ngây để tạo cây mầm
in vitro sau đó lấy vật liệu sinh dưỡng cho nhân giống. Kết quả thí nghiệm thu được như ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của loại hóa chất và thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro Công thức Hóa chất Thời gian (phút) Tổng số mẫu cấy (mẫu)
Mẫu sạch Mẫu sạch tái sinh Thời gian
mẫu nẩy mầm (ngày) Số mẫu sạch (mẫu) Tỷ lệ mẫu sạch (%) Số mẫu sạch nẩy mầm Tỷ lệ mẫu sạch nẩy mầm (%) KT1 HgCl2 0,1% 4 30 25 83,3 22 73,3 8 KT2 6 30 27 90,0 14 46,6 10 KT3 8 30 30 100 4 13,3 12 KT4 Javen 60% (NaClO) 6 30 22 73,3 22 73,3 6 KT5 12 30 30 100 30 100 6 KT6 18 30 30 100 26 86,6 7
Kết quả phân tích phương sai một nhân tố cho thấy Ftính (65,3) > Fcrit (3,1). Như vậy có sự ảnh hưởng rõ rệt giữa các công thức khử trùng, điều này cho thấy loại hóa chất sử dụng để khử trùng và thời gian khử trùng có ảnh hưởng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro của mẫu Chùm Ngây.
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, khi khử trùng bằng HgCl2 0,1% tỷ lệ mẫu sạch cao (83,3 – 100%) nhưng tỉ lệ mẫu tái sinh lại thấp. Khi tăng thời gian khử trùng thì tỷ lệ
mẫu nẩy chồi giảm xuống rất thấp chỉ đạt 13,3 % ở công thức KT2 khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 8 phút và thời gian phôi hạt nảy mầm cũng chậm hơn. Ở công thức KT1 khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 4 phút tỷ lệ mẫu sạch đạt cao nhất đạt 83,3 % và tỷ lệ mẫu nẩy chồi cũng cao nhất đạt 73,3%, thời gian phôi hạt nảy mầm là 10 ngày nuôi trên môi trường.
Khi khử trùng mẫu cấy với hoá chất là Javen 60% đem lại kết quả tốt hơn cho tỉ lệ mẫu sạch và tỉ lệ mẫu tái sinh cao. Thời gian khử trùng 12 phút, tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ mẫu tái sinh cao nhất đạt 100%, sau 6 ngày nuôi phôi hạt đã nảy mầm. Với thời gian khử trùng là 6 và 18 phút cho tỷ lệ mẫu tái sinh thấp hơn chỉ đạt 73,3% và 86,6%.
Từ kết quả trên cho thấy, khử trùng bằng Javen 60% cho kết quả tốt hơn so với HgCl2 0,1%, nguyên nhân là do HgCl2 là chất khử trùng mạnh có độc tính cao đối với tế bào nên khi tăng thời gian khử trùng thì tỷ lệ mẫu sạch tăng nhưng tỷ lệ mẫu tái sinh lại giảm và thời gian hạt nảy mầm cũng chậm hơn.
Vậy công thức khử trùng tốt nhất cho phôi hạt là sử dụng Javen 60% trong thời gian 12 phút cho tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ mẫu tái sinh đều đạt 100%, sau 6 ngày nuôi phôi hạt đã nảy mầm.
Hình 3.1. Hạt Chùm Ngây nảy mầm trên môi trường MS
A. Hạt được khử trùng bằng Javen 60% trong 12 phút; B. Hạt được khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 4 phút.
3.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi Chùm Ngây in vitro Chùm Ngây in vitro
Trong nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro, môi trường dinh dưỡng được xem là nhân tố quan trọng, có ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả nhân giống. Môi trường dinh dưỡng cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng, phát triển và phân hóa của các mô trong suốt quá trình nuôi cấy. Vì vậy, việc nghiên cứu để xác định được môi trường dinh dưỡng phù hợp với từng đối tượng cây trồng ở từng giai đoạn cụ thể trong quy trình nuôi cấy là việc rất cần thiết, để đạt được hiệu quả nuôi cấy cao nhất. Trong thí nghiệm này, sử dụng chồi của cây mầm in vitro để cấy vào các loại môi trường dinh dưỡng cơ bản khác nhau, gồm: Môi trường MS, ½ MS, WPM, B5 Gamborg và Chu (N6) (Bảng 3.2), các loại môi trường này đều được bổ sung 0,5 mg/l BAP + 8 g/l agar + 30 g/l đường sucrose, nhằm xác định môi trường dinh dưỡng thích hợp cho tái sinh chồi Chùm Ngây in vitro. Kết quả thí nghiệm được thu thập sau 2 tuần nuôi cấy và được thể hiện trong bảng 3.2 dưới đây.
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi Chùm Ngây in vitro CTTN Môi trường dinh dưỡng Tổng số mẫu cấy ban đầu (chồi) Số mẫu tái sinh chồi Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (%) TB/mẫuSố chồi Chất lượng chồi MT1 ½ MS 45 25 84,44 1,71 + MT2 MS 45 28 93,33 2,35 +++ MT3 WPM 45 26 88,89 1,86 ++ MT4 (Gamborg)B5 45 20 66,67 1,68 - MT5 N6 (Chu) 45 16 57,78 1,44 -
Ghi chú: MS (Murashige and Skoog medium); WPM (Woody Plant Medium); B5 (Gamborg Medium); N6 (Chu medium)
Kết quả phân tích phương sai một nhân tố về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi Chùm Ngây in vitro, cho kết quả như sau:
Ftính = (24,4) > Fcrit = (3,4), chứng tỏ môi trường dinh dưỡng khác nhau có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tái sinh chồi Chùm Ngây in vitro.
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, Chồi Chùm Ngây được cấy vào môi trường 1/2MS cho số chồi trung bình chỉ đạt 1,71 chồi/mẫu và chất lượng chồi ở mức trung bình (chồi yếu, lá xanh vàng, phiến lá hẹp, mỏng). Ở công thức môi trường MS thì mẫu cấy có khả
năng tái sinh tốt nhất, tỷ lệ mẫu tái sinh đạt 93,33%, số chồi trung bình đạt 2,35 chồi/mẫu và chất lượng chồi tốt (chồi mập, khỏe mạnh, lá xanh đậm, chồi phát triển nhanh).
Trong 3 môi trường còn lại thì môi trường WPM cho tỷ lệ mẫu tái sinh cao hơn cả đạt 88,90 %, số chồi trung bình 1,83 chồi/mẫu; môi trường B5 và N6 cho hiệu quả mẫu tái sinh thấp, chất lượng chồi kém.
Tóm lại, môi trường MS phù hợp nhất cho tái sinh chồi Chùm Ngây trong điều kiện nuôi cấy in vitro.
3.3. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi Chùm Ngây in vitro
Sau khi xác định được môi trường dinh dưỡng thích hợp cho tái sinh chồi Chùm
Ngây in vitro, cần xác định loại chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) và nồng độ của chất ĐHST phù hợp cho sự tái sinh chồi, nhằm xác định công thức môi trường nuôi cấy hiệu quả nhất cho tái sinh chồi Chùm Ngây in vitro. Chất điều hoà sinh
trưởng thường được sử dụng trong giai đoạn này các chất thuộc nhóm Cytokinin để kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và tăng trưởng chồi in vitro. Các loại Cytokinin được sử dụng trong nuôi cấy mô – tế bào là BAP, Kinetin, TDZ, Zeatin,....Trong quá trình nhân nhanh chồi có thể bổ sung Auxin nhưng với hàm lượng ít hoặc không đáng kể, còn hàm lượng Cytokinin lớn để kích thích tạo chồi. Thông qua tham khảo một số công trình nghiên cứu đã công bố, trong thí nghiệm này chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của BAP đến khả năng tái sinh chồi, sau đó sẽ tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp BAP với Kinetin để xác định công thức tốt nhất cho sự tái sinh chồi cây Chùm Ngây.
Trong thí nghiệm này, sử dụng môi trường cơ bản MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BAP với các nồng độ khác nhau: 0 mg/l; 0,2 mg/l; 0,4 mg/l; 0,6 mg/l; 0,8 mg/l; 1,0 mg/l; 2,0 mg/l (Bảng 3.3). Kết quả thí nghiệm được thu thập sau 2 tuần nuôi cấy và được thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi Chùm Ngây
in vitro CTTN BAP (mg/l) Tổng số mẫu cấy (mẫu) Số mẫu tái sinh chồi (mẫu) Tỉ lệ mẫu tái sinh chồi (%) Số chồi TB/mẫu (chồi) Chiều cao TB chồi (cm) CT0 0,0 45 25 55,56 1,15 1,1 CT1 0,2 45 41 91,11 1,63 1,35
CT2 0,4 45 45 100 2,75 2,25
CT3 0,6 45 42 93,33 2,25 1,95
CT4 0,8 45 37 82,22 1,87 1,3
CT5 1,0 45 34 75,56 1,65 1,25
CT6 2,0 45 33 73,33 1,25 1,15
Kết quả phân tích phương sai một nhân tố về tỉ lệ tái sinh chồi và số chồi TB/cụm đều cho thấy Ftính > Fcrit. Kết quả lần lượt là: Ftính (30,9) > Fcrit (2,8); Ftính(80,2) > Fcrit
(2,8). Vậy BAP có sự ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tái sinh chồi Chùm Ngây in vitro. Từ số liệu ở bảng 3.3 cho thấy, công thức môi trường cho tỷ lệ mẫu tái sinh chồi cao nhất là công thức CT2 (100%), tỷ lệ mẫu tái sinh chồi thấp nhất là công thức đối chứng CT0 (55,56 %), với các công thức môi trường khác như công thức CT1; CT3; CT4; CT5 và CT6 đều cho tỉ lệ mẫu tái sinh đạt trên 73%, từ kết quả thu được có thể khẳng định môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng và môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng có sự khác nhau rõ rệt về tỉ lệ mẫu tái sinh chồi cũng như các chỉ tiêu khác như số lượng chồi trung bình và chiều cao của chồi, chứng tỏ BAP ở các nồng độ khác có ảnh hưởng mạnh mẽ tới khả năng phát sinh chồi của mẫu cấy.
Trên công thức CT0 không bổ sung BAP thì tỉ lệ mẫu bật chồi đạt 55,56%, số chồi trung bình thấp chỉ đạt 1,15 chồi /mẫu và chiều cao trung bình của chồi chỉ đạt 1,10 cm. Trên môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng mà mẫu cấy vẫn bật chồi được có thể là do hoocmon nội sinh, nhưng với hàm lượng quá ít không đủ để kích thích mẫu cấy tạo nhiều chồi, đồng thời chiều cao chồi cũng thấp và thời gian bật chồi cũng chậm hơn so với các công thức môi trường có bổ sung BAP. Ở công thức môi trường CT2 (bổ sung 0,4 mg/l BAP) cho tỉ lệ mẫu bật chồi cao nhất đạt 100%, số chồi trung bình cao nhất đạt 2,75 chồi/mẫu cấy và kích thước chồi trung bình đạt cao nhất 2,25 cm. Khi tăng hàm lượng BAP lên 0,6 mg/l thì tỉ lệ mẫu bật chồi giảm chỉ còn 93,33%, kích thước chồi trung bình cũng giảm xuống còn 1,95 cm. Khi tiếp tục tăng hàm lượng BAP ở các thí nghiệm sau thì số mẫu tái sinh chồi và chiều cao của chồi đều giảm, đồng thời thấy xuất hiện khối mô sẹo rất lớn. Dưới đây là hình ảnh chồi chùm Ngây ở các công thức môi trường CT1 và CT2 có bổ sung BAP với hàm lượng lần lượt là 0,2 mg/l BAP và 0,4 mg/l BAP.
Hình 3.2: Chồi Chùm Ngây trên môi trường CT1 (A) và môi trường CT2 (B)
Vậy công thức môi trường CT2 (MS + 30g/l Sucrose + 8g/l Agar + 0,4 mg/l BAP) là công thức môi trường tốt nhất để nhân nhanh chồi Chùm Ngây trong số các công thức môi trường thí nghiệm và công thức môi trường này được sử dụng để tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp giữa BAP và Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Chùm Ngây.
3.4. Ảnh hưởng tổ hợp của BAP và Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi
Nhằm xác định các loại chất ĐHST với với nồng độ thích hợp cho tái sinh chồi Chùm Ngây, trong môi trường nuôi cấy ngoài bổ sung chất ĐHST là BAP chúng tôi nghiên cứu sự ảnh hưởng của sự tổ hợp của BAP với Kinetin. Sử dụng công thức môi trường CT2 (0,4 mg/l BAP) và bổ sung thêm Kinetin ở các nồng độ khác nhau (0,2 mg/l; 0,4 mg/l; 0,6 mg/l; 0,8 mg/l và 1,0 mg/l). Kết quả thí nghiệm thu được sau 2 tuần nuôi được thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4: Ảnh hưởng tổ hợp của BAP và Kinetin đến khả năng tái sinh chồi chùm Ngây in vitro CT7 0,4 0,20 40 40 100 5,25 3,85 CT8 0,40 40 37 92,5 3,37 3,35 CT9 0,60 40 35 87,5 2,74 3,27 CT10 0,80 40 31 77,5 2,63 3,16 CT11 1,00 40 29 72,5 2,35 2,82 A B
Kết quả phân tích phương sai một nhân tố về tỉ lệ tái sinh chồi và số chồi TB/cụm đều cho thấy Ftính > Fcrit. Kết quả lần lượt là: Ftính (10,6) > Fcrit (3,4); Ftính(318,5) > Fcrit
(3,5). Vậy sự tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP và Kinetin có sự ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tái sinh chồi.
Số liệu ở bảng 3.4 cho thấy, sự khác nhau giữa ảnh hưởng tổ hợp của Kinetin và BAP đến khả năng tái sinh chồi so với ảnh hưởng riêng rẽ của BAP. Sau khi nuôi cấy 2 tuần ở công thức CT7 (MS + 0,4 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin) thì tỉ lệ mẫu tái sinh chồi cao nhất đạt 100%, số chồi trung bình là 5,25 chồi/mẫu cấy, chiều cao trung bình của chồi đạt 3,85 cm. Khi tăng hàm lượng Kinetin lên 1,0 mg/l (CT11) cho tỉ lệ mẫu tái sinh chồi, số chồi trung bình/mẫu và chiều cao trung bình của chồi thấp nhất. Các công thức môi trường khác như công thức CT8; CT9; CT10 thì tỉ lệ mẫu tái sinh chồi tương đối cao >75%, nhưng số chồi trung bình/mẫu và chiều cao chồi lại thấp và giảm dần khi hàm lượng Kinetin bổ sung vào môi trường tăng lên lần lượt là 0,4 mg/l; 0,6 mg/l; 0,8 mg/l. Công thức CT7 (0,4 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin) cho số chồi trung bình gấp 1,90 lần và chiều cao chồi trung bình gấp 1,71 lần so với công thức CT2 (công thức tốt nhất khi sử dụng riêng rẽ BAP). Điều này chứng tỏ sự kết hợp giữa BAP và Kinetin sẽ cho hiệu quả tạo chồi tốt hơn và sự tương quan nồng độ giữa BAP và Kinetin có tác động lớn đến tỉ lệ tạo chồi của mẫu nuôi cấy. Khi hàm lượng Kinetin tăng lên thì tỉ lệ mẫu mẫu tái sinh chồi, số chồi trung bình và chiều cao chồi đều giảm, tạo ra khối mô sẹo nhiều hơn.
Theo nghiên cứu của Eufrocinio C. Marfori (2010) cho thấy, môi trường MS có bổ sung 2,5 µM BAP là thích hợp nhất cho tạo chồi, đạt trung bình 4,6 chồi/mẫu thấp hơn so với công thức môi trường có sự kết hợp giữa BAP và Kinetin mà chúng tôi nghiên cứu (số chồi trung bình đạt 5,25 chồi/mẫu ).
Từ kết quả trên chúng tôi đã chọn ra công thức môi trường tốt nhất cho nhân nhanh chồi cây Chùm Ngây in vitro là công thức CT7 (MS + 8g/l Agar + 30g/l Sucrose + 0,4 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin).
Hình 3.3: Chồi Chùm Ngây trên môi trường CT7 sau 1 tuần (A) và 2 tuần (B) nuôi cấy
3.5. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng ra rễ của chồi
Trong nhân giống in vitro môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng phát triển của cây, nó không chỉ ảnh hưởng tới khả năng nhân nhanh chồi mà nó còn ảnh hưởng mạnh mẽ đến khả năng ra rễ của chồi in vitro. Bởi nó là nguồn cung cấp dinh dưỡng cần thiết cho mẫu tồn tại, sinh trưởng và phát triển trong suốt thời gian nuôi cấy.
Hiện nay, có rất nhiều loại môi trường dinh dưỡng khác nhau, thông qua tham khảo các kết quả nghiên cứu đã công bố, chúng tôi tiến hành nuôi cấy chồi Chùm Ngây
in vitro trên môi trường MS + 8 g/l agar + 15g/l sucrose + 0,5 mg/l IBA cho kết quả ra rễ khá cao, số rễ trung bình đạt 4,67 rễ/chồi và chiều dài rễ trung bình 2,17cm. Nhằm xác định công thức môi trường dinh dưỡng để chồi Chùm Ngây ra rễ đạt hiệu quả cao nhất, chúng tôi sử dụng 8 công thức môi trường khác nhau (bảng 3.5): Môi trường MS và ½ MS (giảm ½ hàm lượng các chất khoáng đa lượng và vi lượng) + 8 g/l Agar + 0,5 mg/l IBA, bổ sung đường sucrose với các hàm lượng khác nhau. Sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường ra rễ, kết quả thu được như ở bảng 3.6.
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng ra rễ của chồi Chùm Ngây in vitro CR1 MS 12 45 35 77,78 12 3.95 1,80 CR2 14 45 45 100 7 4.82 2,15