3. đỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.5. Phương pháp xác ựịnh kháng thể Gumboro của gà sau khi dùng vacxin nhược ựộc Gumboro
trở lại bằng nước sinh lý vô trùng. Lấy 1 liều vacxin pha loãng theo cơ số 10, từ 10-1 ựến 10-7.
*Gây nhiễm virus:
+ Mỗi ựộ pha loãng virus sử dụng 4 lọ tế bào ựể gây nhiễm virus. + Mỗi lọ tế bào cho 1ml virus vacxin ựã pha loãng ở mỗi nồng ựộ + Các lọ tế bào ựối chứng không gây nhiễm virus vacxin.
+ Hàng ngày quan sát tế bào dưới kắnh hiển vi, ghi chép thời gian gây huỷ hoại tế bào và ựánh giá kết quả theo sự phá hủy tế bàọ
+ Kết quả thu ựược tắnh chỉ số theo công thức Reed-Muench. Công thức Reed-Muench như sau
Log TCID50 =Log A + X1log f =Log B + X2log f X1 = B - A A - 50 ′ ′ ′ X2 = B - A B - 50 ′ ′ ′ Trong ựó:
A: Số mũ nồng ựộ gây CPE cận trên 50% B: Số mũ nồng ựộ gây CPE cận dưới 50% A/: Tỷ lệ % CPE > 50%
B/: Tỷ lệ % CPE < 50% Log f: Hệ số pha loãng virus.
Vacxin ựạt chỉ tiêu hiệu lực khi có hiệu giá virus có từ 103TCID50/1 liều vacxin.
3.4.5. Phương pháp xác ựịnh kháng thể Gumboro của gà sau khi dùng vacxin nhược ựộc Gumboro vacxin nhược ựộc Gumboro
Dùng phương pháp ELISA gián tiếp ựể phát hiện kháng thể Gumboro trong huyết thanh của gà thắ nghiệm, sử dụng kit CIVTEST AVI IBD.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 40
Nguyên lý hoạt ựộng của kit CIVTEST AVI IBD
THÀNH PHẦN KIT
Sản phẩm Số lượng
Vi bản 96 giếng (trong 8 dãy) có gắn kháng nguyên ựặc hiệu
của IBDV 5
Lọ số 0: Dung dịch rửa (x 10) 2 x 100 ml
Lọ số 1: Chất pha loãng mẫu (x 10): chất pha loãng mẫu
ựậm ựặc có chứa thuốc nhuộm xanh lá cây 125 ml
Lọ số 2: Dung dịch conjugate: Dung dịch Horseradish peroxidase dán nhãn (rabbit anti Ờchicken IgY) có chứa thuốc nhuộm ựỏ. Sử dụng ngay
30 ml
Lọ số 3: Dung dịch nền: Dung dịch ABTS. Sử dụng ngay 30 ml Lọ số 4: Dung dịch STOP: Dung dịch acid oxalic. Sử dụng
ngay 30 ml
Lọ số 5: đối chứng dương: huyết thanh ựối chứng dương ựược
pha loãng trước có chứa thuốc nhuộm vàng. Sử dụng ngay 2.2 ml
Lọ số 6: đối chứng âm: huyết thanh ựối chứng âm ựược pha
loãng trước chứa thuốc nhuộm xanh dương. Sử dụng ngay 2.2 ml
Bìa dắnh vi bản 5
Hướng dẫn sử dụng Kit (insert) 1
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 41
CIVTEST AVI IBD hoạt ựộng dựa trên nền tảng của kỹ thuật ELISA gián tiếp. Kháng nguyên ựặc hiệu của virus gây bệnh viêm túi Fabricius truyền nhiễm (virus gây bệnh Gumboro) ựược gắn vào ựáy giếng của 1 vỉ gồm 96 giếng. Khi ủ mẫu trong giếng kiểm tra, kháng thể ựặc hiệu của virus Gumboro sẽ gắn kết với kháng nguyên ựã ựược gắn ở ựáy giếng và không bị rửa trôi sau hoạt ựộng rửa ựể loại bỏ những thành phần không kết hợp. Tiếp theo, conjugate ựược thêm vào ựể kết hợp với mọi kháng thể của gà. Conjugate không kết hợp sẽ bị rửa trôi và cơ chất ựặc hiệu với enzyme ựược thêm vàọ Màu của hỗn dịch xuất hiện ở mỗi giếng tương ứng với lượng kháng thể ựặc hiệu ựối với virus Gumboro của gà hiện diện trong mẫu ựược pha loãng.
Chất bảo quản ựược sử dụng trong thuốc thử dạng nước là hỗn hợp của methylisothiozolone và bromonitrodioxanẹ
Nguyên vật liệu cần ựược chuẩn bị thêm:
Tủ ấp 37oC, pipette ựơn và nhiều rãnh chắnh xác với các ựầu gắn pipette chỉ sử dụng 1 lần, bản pha loãng dùng ựể pha loãng mẫu, bảng ựọc 96 giếng, nước cất và thiết bị rửa vi bản.
TIẾN HÀNH TEST
- để thuốc thử ở nhiệt ựộ phòng và ựã trộn ựều chúng bằng máy lắc - Ghi chép mẫu và các vị trắ ựối chứng trên một tờ giấỵ Các ựối chứng âm và dương phải ựược chạy hai lần.
1. Nhỏ 50 ộl ựối chứng và 50 ộl dung dịch mẫu ựã pha loãng ở tỷ lệ 1/500 vào các giếng theo ựúng sơ ựồ ựĩa ELISA
2. đậy vỉ bằng bìa dắnh và ủ 30 phút ở +37oC.
3. Lấy bìa dắnh ra và rửa vỉ 3 lần với dung dịch rửa ựã pha loãng (300
ộl cho 1 giếng). Xoay ngược và làm khô kỹ lưỡng trên giấy thấm. 4. Thêm 50 ộl dung dịch conjugate (lọ số 2) vào mỗi giếng. 5. đậy vỉ bằng bìa dắnh và ủ 30 phút ở +37oC.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 42
cho 1 giếng). Làm khô như hướng dẫn trên.
7. Thêm 50 ộl dung dịch ABTS vào mỗi giếng. Lắc ựều vỉ trong 2 giâỵ 8. đậy vỉ bằng bìa dắnh và thúc ựẩy phản ứng tạo màu trong vòng 30 phút
ở 37oC ở nơi tối
9. Lấy bìa dắnh ra và thêm 50 ộl dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng. Trộn ựều bằng cách lắc nhẹ mặt vỉ.
10.đọc kết quả ở bước sóng 405 nm. * LƯU Ý
- Thẩm ựịnh test: Test có giá trị khi giá trị trung bình OD405 của ựối chứng dương > 0.5 và tỷ lệ (giá trị trung bình OD405 của ựối chứng dương/giá trị trung bình OD405 của ựối chứng âm) > 6.0