tạo thành
- Các phương pháp chiết tách: Sử dụng dung môi hữu cơ hoặc dung môi thân nước.
- Các phương pháp kết tinh: Cất loại dung môi, thay đổi dung môi, thay đổi nhiệt độ…
- Các phương pháp lọc: Lọc hút chân không, lọc dưới áp suât thường… 2.3.4. Phương pháp khẳng định cấu trúc
Các chất tổng hợp được xác định cấu trúc bằng các loại phổ sau: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H- NMR).
- Phổ hồng ngoại (IR): phổ hồng ngoại được ghi trên máy Perkin Elmer với kĩ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-400cm-1. Các mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ 1:200 rồi ép dưới dạng film mỏng dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm .
- Phổ khối lượng (MS): phổ khối lượng các chất được ghi bằng máy đo phổ khối lượng LC-MSD-Trap-SL và máy đo phổ khối lượng phân giải cao FT-ICR-MS-Varian 910MS tại Viện hoá học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR) được ghi trên máy Bruker AV- 500 tại Viện hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả thực nghiệm
3.1.1. Tổng hợp N-acetyl-L-tyrosin Sơ đồ phản ứng: Sơ đồ phản ứng:
+ Cách tiến hành: Tiến hành theo phương pháp đã được Willian Thomas Brady mô tả [2,11,17].
Cho vào bình cầu hai cổ 2l: 27,00 g (0,15 mol) L-tyrosin, 48,0 ml H2O, 75,0 ml NaOH 2M, khuấy cho tan hoàn toàn. Làm lạnh bình cầu bằng nước đá xuống 5oC. Nhỏ từ từ vào hỗn hợp 8 lần, mỗi lần 45,0 ml NaOH 2M và 4,5 ml anhydrid acetic, duy trì nhiệt độ dưới 5oC bằng nước đá và đảm bảo NaOH 2M luôn cho trước trong suốt quá trình nhỏ. Tiếp tục khuấy ở nhiệt độ phòng thêm 30 phút để loại anhydrid còn dư. Sau đó điều chỉnh dung dịch phản ứng tới pH=2 bằng 201,0 ml H2SO4 6N. Để ở tủ lạnh qua đêm để L-tyrosin dư kết tủa. Lọc bỏ phần tủa, cất quay đến kiệt phần dịch lọc thu được chất rắn màu trắng. Thêm 250,0 ml ethanol 96ođể hòa tan N-acetyl-L-tyrosin, lọc bỏ phần muối không tan, cất chân không đến kiệt dịch lọc, cất thêm 40 phút để loại hết acid acetic thu được chất bán rắn màu vàng nhạt. Thêm 40,0 ml H2O, sản phẩm nhanh chóng kết tinh, lọc, rửa bằng HCl 1N 2 lần, rồi rửa bằng nước, sấy khô thu được chất kết tinh màu trắng.
Kết quả:
- Khối lượng sản phẩm 26,82 g, hiệu suất thô 80,62%.
- Kết tinh lại trong methanol thu được tinh thể không màu hình kim, nhiệt độ nóng chảy 149-150oC (152-153oC theo tài liệu [17]).
- Sắc ký lớp mỏng cho 1 vết Rf=0,54 (dicloromethan: methanol= 9: 1), phun ninhydrin không hiện màu.
3.1.2. Tổng hợp O-methyl-N-acetyl-L-tyrosin ethyl ester
Từ N-acetyl-L-tyrosin để tổng hợp được O-methyl-N-acetyl-L-tyrosin ethyl ester phải trải qua 2 phản ứng ester hóa và O-methyl hóa.
- Tổng hợp N-acetyl-L-tyrosin ethyl ester bằng phản ứng ester hóa
Chúng tôi tiến hành phản ứng ester hóa trong điều kiện tối ưu đã được khảo sát trong Luận văn Thạc sĩ của Th.S Nguyễn Văn Giang [2].
Thêm vào bình cầu 2 cổ 250ml 18,4ml ethanol, làm lạnh bên ngoài bình cầu bằng nước đá xuống 5oC. Nhỏ cẩn thận từ từ 9,5 ml SOCl2 vào bình phản ứng. Đun hồi lưu hỗn hợp trong 1 giờ để loại toàn bộ khí HCl sinh ra. Thêm vào khối phản ứng dung dịch 22,30 g (0,1 mol) N-acetyl-L-tyrosin hòa tan trong 55,0 ml ethanol. Tiếp tục đun hồi lưu trong 3 giờ thì phản ứng kết thúc. Cất quay đến kiệt khối phản ứng thu được chất bán rắn màu vàng nhạt. Sắc ký cho một vết Rf=0,57 (hệ diclomethan: methanol= 9: 1).
Nhận thấy sản phẩm thô 3 không chứa các tạp có thể ảnh hưởng tới phản ứng sau và chứa rất ít nước chúng tôi quyết định sử dụng nó để tiến hành phản ứng tiếp theo.
- Tổng hợp O-methyl-N-acetyl-L-tyrosin ethyl ester bằng phản ứng O- methyl hóa với tác nhân dimethyl sulfat
Thêm vào bình cầu 2 cổ 130,0 ml aceton, toàn bộ lượng chất 3 thô thu được ở trên, khuấy mạnh để hòa tan hết chất 3. Thêm 21,00 g (0,15 mol) K2CO3 khan đã được nghiền nhỏ, khuấy trong 30 phút. Nhỏ từ từ 10,9 ml (0,12 mol) dimethyl sulfat vào hỗn hợp phản ứng. Khuấy tiếp trong 24 giờ. Lọc phần rắn, cất quay dịch lọc đến kiệt thu được chất rắn màu trắng ngà.
Để tìm được điều kiện tối ưu cho phản ứng tổng hợp hợp chất 4 chúng tôi tiến hành khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng tới phản ứng methyl hóa: tỷ lệ tác nhân dimethyl sulfat: ester 3; base sử dụng cho phản ứng. Ester 3 sử dụng trong các khảo sát đã được kết tinh lại trong ethanol 30o từ sản phẩm thô.
Khảo sát tỷ lệ tác nhân dimethyl sulfat : ester 3 với các điều kiện sau: Nhiệt độ phản ứng là: 20±5oC.
Tỷ lệ mol dimethyl sulfat : ester 3 khảo sát là 1,0; 1,1; 1,2; 1,3; 1,4. Thời gian: 24h
Base là K2CO3 với khối lượng 0,42 g (3mmol). Khối lượng ester 3:0,50 g (2mmol).
Kết quả khảo sát tỷ lệ tác nhân dimethyl sulfat : ester 3 thống kê trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Tỷ lệ tác nhân ảnh hưởng tới hiệu suất phản ứng methyl hóa
STT Thể tích dimethyl sulfat (ml) Tỷ lệ mol dimethyl sulfat : ester 3 Khối lượng sản phẩm (g) Hiệu suất phản ứng (%) 1 0,19 1,0 0,43 81,5 2 0,21 1,1 0,46 87,1 3 0,23 1,2 0,47 89,0 4 0,25 1,3 0,48 90,9 5 0,27 1,4 0,47 89,0
Nhận xét:
Hiệu suất phản ứng nhìn chung tăng khi tăng tỷ lệ dimethyl sulfat nhưng sự khác biệt không nhiều khi tăng tỷ lệ từ 1,2 lên 1,3 và 1,4. Do đó chúng tôi lựa chọn tỷ lệ dimethyl sulfat là 1,2 so với ester 3.
Khảo sát các loại base sử dụng cho phản ứng với các điều kiện sau: Nhiệt độ phản ứng là: 200C.
Tỷ lệ mol dimethyl sulfat : ester 3=1,2. Khối lượng 3:0,50 g (2mmol).
Các loại base khảo sát: NaOH rắn, K2CO3 khan, TEA, pyridine với tỷ lệ mol: ester 3=1,5.
Kết quả khảo sát này ghi lại trong bảng 3.2 dưới đây.
Bảng 3.2. Khảo sát các loại tác nhân base cho phản ứng methyl hóa
STT Xúc tác sử dụng Thời gian (Giờ) Khối lượng sản phẩm (g) Hiệu suất phản ứng (%) 1 NaOH rắn 8 0,29 54,9 2 K2CO3 khan 24 0,47 89,0 3 TEA 24 Không phản ứng 0 4 Pyridin 24 Không phản ứng 0 Nhận xét:
Với các tác nhân base TEA và pyridin, phản ứng không diễn ra (có thể do bị lẫn nước).
Với NaOH rắn phản ứng diễn ra nhanh tuy nhiên không hoàn toàn. Sắc ký lớp mỏng cho kết quả giống nhau với thời gian 8 giờ và 24 giờ. Như vậy phản ứng giữa nhóm –OH phenol và NaOH đã giải phóng H2O gây thủy phân tác nhân dimethyl sulfat làm giảm hiệu suất phản ứng.
Từ các kết quả khảo sát, chúng tôi sử dụng trực tiếp sản phẩm thô từ phản ứng ester hóa để tiến hành phản ứng ở nhiệt độ phòng, sử dụng K2CO3 khan, tỷ lệ dimethyl sulfat: amid 2=1,2.
Kết quả thu được từ hai phản ứng ester hóa và O-methyl hóa:
-Từ 22,30 g hợp chất 2, KL O-methyl-N-acetyl-L-tyrosin ethyl ester thu được là 23,10 g. Hiệu suất chung của 2 phản ứng ester hóa và methyl hóa đạt 87,17%. Kết tinh lại trong cồn 30o thu được 4 dưới dạng tinh thể màu trắng.
-Sắc ký cho 1 vết duy nhất Rf =0,70 (hệ diclomethan: methanol=9:1). -Nhiệt độ nóng chảy từ 139-140oC (kết tinh lại trong ethyl acetat, 141- 142oC theo tài liệu [16]).
3.1.3. Khử hóa tạo thành (S)-N-[1-hydroxy-3-(4-methoxyphenyl)propan-2-yl]acetamid yl]acetamid
Tổng hợp (S)-N-[1-hydroxy-3-(4-methoxyphenyl)propan-2-yl]acetamid theo phản ứng sau:
Chúng tôi sử dụng phương pháp của H. Kohno và cộng sự để tiến hành phản ứng khử hợp chất 4 [18]. (Phương pháp của H. Kohno tiến hành đối với một ester tương tự hợp chất 4).
Hòa tan 9,27 g (35 mmol) O-methyl-N-acetyl-L-tyrosin ethyl ester trong 50,0 ml ethanol 96o trong bình cầu 500ml. Làm lạnh bên ngoài bình cầu bằng nước đá tới 5oC. Thêm vào dung dịch phản ứng 3,30 g (87 mmol) NaBH4 rắn. Tiếp tục khuấy ở nhiệt độ phòng thêm 7 giờ thì phản ứng hoàn tất.
Thêm từ từ vào khối phản ứng đã được làm lạnh bằng nước đá 5,0 ml aceton để loại NaBH4 dư. Nhỏ từ từ vào hỗn hợp 6,5 ml HCl đặc để chuyển
hợp chất 5 sang dạng tự do. Cất quay đến kiệt, thu được hỗn hợp chất rắn A, thêm 5,0 ml H2O, chiết bằng ethylacetat 3 lần, mỗi lần 25,0 ml. Làm khan pha hữu cơ bằng Na2SO4 khan. Cất quay đến kiệt pha hữu cơ, thêm 10,0 ml H2O, (S)-N-[1-hydroxy-3-(4-methoxyphenyl)propan-2-yl]acetamid kết tinh dưới dạng tinh thể không màu.
+ Kết quả:
KL sản phẩm 7,12 g, hiệu suất 91,7%.
Nhiệt độ nóng chảy từ 97-99oC (kết tinh lại trong ethyl acetat: n-hexan tỷ lệ 1:1, 97-99oC theo tài liệu [17]).
SKLM cho một vết Rf=0,37 (dicloromethan: methanol = 9: 1).
Chúng tôi tiến hành khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất và thời gian của quá trình phản ứng khử: dung môi, tỷ lệ tác nhân khử NaBH4. Tiến hành với 0,50 g (1,9 mmol) O-methyl-N-acetyl-L-tyrosin ethyl ester, tại nhiệt độ phòng.
+ Khảo sát ảnh hưởng của dung môi.
Kết quả khảo sát với các dung môi THF, ethanol tuyệt đối, ethanol 96o, ethanol 80o (tỷ lệ tác nhân khử NaBH4: ester 4=2,5) thu được trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của dung môi tới phản ứng khử
STT Dung môi Thời gian phản ứng kết thúc (giờ) Khối lượng sản phẩm (g) Hiệu suất phản ứng (%) 1 THF Không phản ứng 0 0 2 Ethanol tuyệt đối 10h 0,34 80,81 3 Ethanol 96o 7h 0,33 78,43 4 Ethanol 80o 5h 0,29 68,92
Nhận xét:
Phản ứng khử với tác nhân NaBH4 không diễn ra với dung môi không phân cực.
Với dung môi ethanol, tăng tỷ lệ nước sẽ làm giảm thời gian phản ứng nhưng cũng làm giảm hiệu suất phản ứng. Tuy nhiên, thay ethanol tuyệt đối bằng ethanol 96o hiệu suất thay đổi không đáng kể. Do đó có thể sử dụng ethanol 96o thay thế.
+ Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ tác nhân khử NaBH4: ester 4.
Khảo sát với tỷ lệ NaBH4: ester 4 là 2; 2,5; 3; 3,5 (sử dụng dung môi ethanol 96o ).
Kết quả của khảo sát được ghi lại trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ NaBH4: ester 4 tới phản ứng khử
STT Khối lượng NaBH4 (g) Tỷ lệ mol NaBH4: ester 4 Thời gian phản ứng kết thúc (giờ) Khối lượng sản phẩm (g) Hiệu suất phản ứng (%) 1 0,14 2 8,5 0,32 76,05 2 0,18 2,5 7 0,33 78,43 3 0,22 3 7 0,33 78,43 4 0,26 3,5 7 0,33 78,43 Nhận xét:
Tỷ lệ NaBH4 : ester 4 tăng từ 2 lên 2,5 lần thời gian phản ứng giảm nhưng khi tăng từ 2,5 lần lên 3,5 lần thời gian không giảm nữa do NaBH4 đã đạt tới trạng thái bão hòa trong ethanol 96o.
Khi tăng tỷ lệ NaBH4 trong khoảng từ 2 đến 3,5 lần so với ester 4 hiệu suất thay đổi không đáng kể.
Để tiết kiệm tác nhân NaBH4 có thể sử dụng tỷ lệ 2,5 để tiến hành phản ứng
Như vậy chúng tôi lựa chọn dung môi ethanol 96o, lượng tác nhân khử gấp 2,5 so với ester 4, điều kiện nhiệt độ phòng để tiến hành phản ứng.
3.1.4. Tổng hợp (S)-2-acetamido-3-(4-methoxyphenyl)propyl-4-methylbenzen sulfonat sulfonat
Các phản ứng tosyl hóa 5 được các tác giả thực hiện với xúc tác chuyển pha n-Bu4NHSO4 hoặc xúc tác TEA. Để giảm lượng dung môi hữu cơ phải sử dụng và tránh sử dụng các xúc tác khó kiếm, chúng tôi nghiên cứu phản ứng tosyl hóa với xúc tác pyridin và với NaOH/Na2CO3 bão hòa.
a, Tosyl hóa với xúc tác pyridin Phản ứng như sau:
Hòa tan 0,50 g (2,2 mmol) hợp chất 5 trong 5,0 ml pyridin trong bình cầu 50 ml. Làm lạnh bình phản ứng bằng nước đá, thêm 0,63 g (3,3 mmol) tosyl clorid vào khối phản ứng, khuấy từ. Duy trì nhiệt độ bên ngoài ở 0oC. Sau 2 tiếng khuấy trộn, để tủ lạnh qua đêm rồi cất chân không để loại hết pyridin, thu được chất bán rắn. Thêm 15,0 ml aceton để hòa tan chất bán rắn trên, đổ dung dịch 14 trong aceton vào nước thu được tủa. Lọc tủa rửa bằng HCl 1N 2 lần, rồi rửa bằng H2O. Kết quả:
- Thu được 0,21 g dẫn chất tosylat, hiệu suất 25,20%. - Rf = 0,84 (diclomethan: methanol = 9: 1).
- Nhiệt độ nóng chảy 78-80oC (80-81o trong tài liệu [18]).
Như vậy tiến hành trong pyridin phản ứng xảy ra với hiệu suất rất thấp, không thể áp dụng trong công nghiệp.
b, Tosyl hóa với NaOH/Na2CO3
Tosyl hóa với NaOH/Na2CO3 theo phản ứng dưới đây:
Hòa tan 0,50 g (2,2 mmol) hợp chất 5 trong 15,0 ml diclomethan trong bình cầu 50ml. Làm lạnh bên ngoài bình cầu bằng nước đá. Thêm 0,50 g (2,62 mmol) tosyl clorid vào hỗn hợp. Nhỏ giọt 2,0 ml dung dịch Na2CO3 bão hòa vào khối phản ứng, rồi sau đó thêm 0,20 g (5 mmol) NaOH rắn. Duy trì nhiệt độ bên ngoài bình là 00C và khuấy trộn mạnh trong suốt quá trình phản ứng. Sau 1,5 giờ phản ứng diễn ra hoàn toàn, thêm 15,0 ml H2O, chiết lấy pha hữu cơ rồi rửa bằng NaOH 2N 2 lần, mỗi lần 15,0 ml để loại tosyl clorid dư, rửa tiếp bằng nước. Làm khan pha hữu cơ rồi cất quay đến kiệt thu được chất bán rắn màu vàng nhạt.
Kết quả:
KL sản phẩm= 0,70 g. Hiệu suất 84,37%.
Kết tinh lại trong ethyl acetat-n-hexan cho chất rắn không màu. Rf=0,84 (diclomethan: methanol = 9: 1). Nhiệt độ nóng chảy 79-81oC (80-81oC theo tài liệu [18]).
3.1.4. Tổng hợp (S)-N-[1-cloro-3-(4-methoxyphenyl)propan-2-yl]acetamid Phản ứng như sau: Phản ứng như sau:
Thêm từ từ 0,72 ml thionyl clorid vào dung dịch của 2 g (S)-N-[1- hydroxy-3-(4-methoxyphenyl)propan-2-yl]acetamid trong 10,0 ml toluen tại nhiệt độ phòng. Đun hồi lưu hỗn hợp trong 2h rồi làm lạnh về nhiệt độ phòng.
Cất chân không tới kiệt, rồi thêm 5,0 ml nước thu được tinh thể vàng nhạt của 14.
Kết quả:
- KL sản phẩm=1,82 g, hiệu suất 84%. - Rf=0,78 (diclomethan: methanol = 9: 1).
- Nhiệt độ nóng chảy=74-77oC (chưa tìm được tài liệu công bố nhiệt độ nóng chảy).
3.1.5. Tổng hợp hợp chất trung gian 13 (ether)benzoxytosylat
Tổng hợp chất trung gian 2-[(2-ethoxyphenoxy)]ethyltosylnat theo 2 phản ứng dưới đây:
Thêm 13,1 ml cloroethanol vào dung dịch của 5,0 ml 2-ethoxyphenol hòa tan trong 118,7ml NaOH 1N. Hỗn hợp sau 48 giờ khuấy trộn tạo thành 2- (2-ethoxyphenoxy)ethanol 12 kết tủa ở dạng keo. Chiết khối phản ứng 3 lần x 20,0 ml ethyl acetat. Rửa dịch chiết bằng nước, làm khan dịch chiết bằng Na2SO4 rồi cất quay đến kiệt thu được chất bán rắn màu vàng. Thêm 5,0 ml H2O, để ở lạnh, gại bình cầu thu được 12 ở dạng kết tủa màu vàng nhạt.
Kết quả:
- KL sản phẩm 5,92 g, hiệu suất đạt 84,47%.
- SKLM cho một vết với Rf đo được bằng 0,78 trong dicloromethan: methanol = 9: 1 và bằng 0,29 trong dicloromethan: methanol = 60: 1.
Đi từ 0,50 g hợp chất 12 tổng hợp dẫn chất tosylat theo phương pháp đã được mô tả trong phần tosyl hóa (S)-N-[1-hydroxy-3-(4- methoxyphenyl)propan-2-yl] acetamid với tác nhân tosyl clorid và NaOH/Na2CO3 kết quả thu được:
Khối lượng sản phẩm 0,59g. Hiệu suất 73,5%.
SKLM cho một vết với Rf=0,71 với hệ dung môi khai triển dicloromethan: methanol = 60: 1.
Nhiệt độ nóng chảy 81-83oC (kết tinh lại trong diclomethan - n-hexan, theo tài liệu [17] là 82-83oC).
3.2. Xác định cấu trúc các chất tổng hợp được bằng phương pháp phổ
3.2.1. Kết quả phân tích phổ IR
Bảng 3.5. Kết quả phân tích phổ IR
Phụ
lục Chất Công thức cấu tạo
Đỉnh hấp thụ (cm-1) Nhóm chức 1 2 3539 O-H phenol 3326 N-H amid 3100-3400 O-H liên kết H 3030 C-H thơm 2958, 2851 C-H no 1734 C=O acid 1656 C=O amid 1544, 1455 C=C thơm 1254 C-O 2 4 3343 N-H amid 3050 C-H thơm 2974, 2834 C-H no 1742 C=O ester 1652 C=O amid 1520,1450 C=C thơm 1254 C-O ester
3 5 3350 O-H alcol