trong môi trường pH dạ dày.
Mục tiêu: Khảo sát khả năng bảo vệ vi sinh vật của alginat đối với vi sinh vật
Tiến hành:
Nuôi cấy vi sinh vật trong bình nón chứa 200ml môi trường MRS lỏng trong 24h (theo phương pháp nêu trong mục 2.3.2).
Thu gạn bỏ một phần dịch trong, giữ lại khoảng 60ml HDSK ở phía đáy, tạo mẫu tiền đông gồm: hỗn dịch sinh khối trộn đồng lượng với dung dịch sữa gầy 20%.
Đông khô các mẫu (theo phương pháp nêu trong mục 2.3.4.)
Thu sản phẩm, bảo quản trong túi polymer kín đặt trong lọ thủy tinh.
Đếm số lượng vi sinh vật có trong 1g nguyên liệu bột đông khô trước khi thử trong môi trường acid pH 1,2 theo phương pháp xác định số lượng vi sinh vật bằng pha loãng liên tục (được nêu trong mục 2.3.5.)
Làm nhỏ bột đông khô trong túi bảo quản.
Cho lần lượt từng mẫu vào bình nón chứa 100ml dung dịch HCl pH 1,2 (được pha theo phương pháp nêu trong mục 2.3.4.). Khuấy từ với tốc độ 50 vòng/ phút. Các mẫu có thành phần như sau:
Mẫu a: Bột đông khô Lactobacilus acidophilusvới dung dịch sữa gầy 10%.
(Bột đông khô)
Mẫu b: Bột đông khô + tinh bột.
Mẫu c: Bột đông khô + alginat.
Sau 1h, đồng nhất hóa mẫu trong bình. Nhanh chóng hút chính xác 1 ml dịch trong bình tiến hành pha loãng tiếp (theo phương pháp nêu trong mục 2.3.5).
Sau khuấy từ 2h, đồng nhất hóa lại dịch trong bình 2. Nhanh chóng hút chính xác 1ml dịch trong bình này tiến hành pha loãng (theo phương pháp nêu trong mục
2.3.5).
Tiến hành tương tự với các bình chứa 2 mẫu còn lại.
Ủ trong tủ CO2 5% trong, sau 48h tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc. Tính số lượng vi sinh vật còn sống sót (theo công thức nêu trong phần 2.3.5.)
Tỉ lệ VSV sống sót của mẫu sử dụng alginat làm tá dược độn cho tỉ lệ %vi sinh vật sống sót sau 1h và 2h cao hơn khoảng 40 lần so với khi sử dụng tá dược độn là tinh bột và mẫu không sử dụng bột đông khô. Mẫu c cho số lượng VSV sống sót vào khoảng 107, trong khi mẫu a và mẫu b cho số lượng VSV sống sót khoảng 105 đến 106
.
Tác dụng bảo vệ củaalginattrên các vi sinh vậttrong điều kiện acid pH thấp của dạ dàycó thể giải thích như sau: khi tiếp xúc với dung dịch acid pH thấp muối natri alginat chuyển thành dạng acid alginic không tan. Acid alginic trương nở tạo ra một lớp màng bao quanh bột đông khô chứa vi sinh vật, cách li vi sinh vật với điều kiện bất lợi của môi trường xung quanh [30].
Bảng 3.6. Số lượng vi sinh vật sống sót tính trên 1g bột đông khô sau thời gian được ngâm trong môi trường acid HCl pH 1,2
0h Sau 1h Sau 2h
Mẫu c Mẫu b Mẫu a Mẫu c Mẫu b Mẫu a Lần 1 1,0x 109 9,8 x 106 6,6 x 105 6,3x 105 4,1x 106 2,0x 105 1,9 x 105
Lần 2 1,9x 109 2,2 x 107 3,1 x 105 2,9x 105 1,3x 107 2,6x 105 2,6x 105
Lần 3 2,2x 109 2,4 x 107 4,6 x 105 4,7x 105 1,6x 107 4,0x 105 4,3x 105
SLTB 1,7x 109 1,9 x 107 4,8x 105 4,6x 105 1,1x 107 2,9x 105 2,9x 105 Chú thích: SLTB: số lượng tế bào trung bình
Hình 3.5. Biểu đồ thể hiện số lượng vi sinh vật sống sót sau khi thử trong môi trường acid HCl pH 1,2
Hai mẫu b và a cho trong các lần cùng thử nghiệm thì cho số lượng VSV sống sót ngang nhau. Điều này chứng tỏ việc bổ sung thêm tá dược độn là tinh bột không hề giúp cải thiện số lượng VSV sống sót trong điều kiện acid dạ dày.
So sánh kết quả thí nghiệm này với kết quả trong nghiên cứu của Latha Sabikhi năm 2010 khi đánh giá khả năng bảo vệ L.acidophilustrong chế phẩm probiotic bằng phương pháp tạo vi nang với alginat. Với nguyên liệu ban đầu chứa khoảng 109 cfu/g thì mẫu không được bảo vệ đều có số lượng sống sót sau 1h, 2h trong điều kiện pH 1 giảm xuống còn khoảng 105
÷106 cfu/g (giảm khoảng 1000 lần). Ở nghiên cứu của Latha Sabikhivới phương pháp tạo vi nang bảo vệ thì sau 1h trong pH 1 số lượng Lactobacillus acidophilus LA1 giảm từ 107
cfu/g lúc ban đầu xuống còn khoảng 106
cfu/g(nghĩa là giảm khoảng 10 lần), sau 2h trong điều kiện acid pH 1, số lượng VSV của mẫu bao vi nang còn 105 cfu/g (giảm 100 lần so với ban đầu). Còn trong thí nghiệm có sử dụng alginat làm tá dược độn thì sau 1h trong môi trường acid HCl pH 1,2 số lượng vi sinh vật giảm từ 1,7 x 109
cfu/g xuống còn khoảng 1,9 x 107 cfu/g (tương đương khoảng xấp xỉ 100 lần), còn tại thời điểm sau 2h lượng vi sinh vật còn lại là khoảng 1,1 x 107 cfu/g (giảm khoảng 155 lần so với ban đầu).
Tóm lại, kết quả thí nghiệm cho thấy mẫu nguyên liệu sử dụng natri alginat làm tá dược độn cho tỉ lệ sống sót trong môi trường acid pH 1,2 cao hơn so với mẫu thử với bột đông khô và mẫu bột đông khô có sử dụng thêm tá dược độn là tinh bột. Từ đó có thể sơ bộ kết luận natri alginat khi sử dụng làm tá dược độn trong chế phẩm vi sinh với tỉ lệ cao (trong thí nghiệm này là 50%) cho hiệu quả làm gia tăng tỉ lệ sống sót của L.acidophilus ATCC 4653