tục
Cân, đong chính xác các thành phần theo công thức môi trường MRS đặc (nêu trong mục 2.1.2.). Hòa tan các thành phần tan trong nước, phân tán thạch vào dung dịch đựng trong bình nón thích hợp. Đậy kín bằng nút bông. Hấp tiệt khuẩn ở 115oC/ 20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn. Lấy bình đựng môi trường ra khỏi nồi hấp, phân phối môi trường lên các đĩa petri đã được rửa sạch, hấp tiệt khuẩn và sấy khô.(bề dày lớp thạch trên các đĩa khoảng 2mm) sao cho mặt thạch nhẵn, phẳng. Chờ cho thạch nguội và đông rắn lại, đậy kín.
Chuẩn bị các ống nghiệm sạch mỗi ống chứa 9ml nước cất, đậy kín, hấp tiệt khuẩn ở 115oC / 20 phút, để nguội xuống nhiệt độ khoảng 37 ÷ 40o
C.
Xác định số lượng VSV trong 1ml dịch nuôi cấy ban đầu.
Hút chính xác 1ml hỗn dịch sinh khối pha vào ống nghiệm thứ nhất,lắc đều. Hút chính xác 1ml dịch đã được đồng nhất trong ống nghiệm thứ nhất pha loãng sang ống nghiệm thứ 2 (chứa 9ml nước cất), lắc đều. Cứ tiếp tục pha loãng như vậy cho tới nồng độ pha loãng cuối cùng (trong thí nghiệm này là 10-7
, 10-8, 10-9). Cấy trải lên mỗi đĩa petri 0,5ml dịch trong các ống pha loãng ở trên (làm trên 3 nồng độ cuối, mỗi nồng độ cấy trên 2 đĩa).
Đối với mẫu nguyên liệu rắn cần xác định số lượng VSV còn sống sau đông khô Làm nhỏ nguyên liệu, cân chính xác khối lượng của mẫu, sau đó pha vào bình nón chứa 100ml nước cất đã được hấp tiệt khuẩn ở 115oC/20 phút. Phân tán đều mẫu trong H2O bằng khuấy từ, sau đó hút chính xác 1ml dịch từ bình nón pha vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất, rồi tiếp tục pha loãng, cấy như đối với mẫu là chất lỏng như trên.
Mẫu khảo sát số lượng sống sót trong điều kiện môi trường pH thấp:
Cân chính xác khoảng 1,0g mẫu cần thử, cho vào bình nón chứa 100ml acid HCl pH 1,2 (pha theo Phụ lục 2) đã được hấp tiệt khuẩn ở 115o
C/20 phút. Khuấy từ với tốc độ 50 vòng/ph trong 1h, 2h. Lấy mẫu tại các thời điểm 0h, 1h, 2h, tiến hành pha loãng liên tục như các bước đã nêu ở trên đến (nồng độ pha loãng 104
, 10-5; 10-6 6
; 10-7), cấy trải dịch trong 3 nồng độ pha loãng cuối cùng lên mặt thạch MRS, mỗi đĩa 0,5ml, dàn đều dịch trên bề mặt thạch bằng que chang đã được tiệt khuẩn.
Ủ các đĩa này trong tủ CO2 5%, ở nhiệt độ 37o C. Tiến hành xác định số lượng VSV trên các mẫu:
- 1ml dịch nuôi cấy sau 24h. - Mẫu tạo thành sau đông khô.
- Mẫu sau khi ủ trong dịch acid pH 1,2 trong 1h, 2h. Sau 48h đọc kết quả
Số lượng VSV có trong 1g nguyên liệu hoặc 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu được tính theo công thức:
Trong đó:
m: khối lượng mẫu đem tiến hành xác định số lượng. X: số VSV có trong 1 g hoặc 1 ml mẫu.
An: Số khuẩn lạc mọc trên các đĩa petri có cấy các nồng độ pha loãng n.