- Xử lý phản ứng:
b. Phổ 13C-NMR
3.4.3.1. Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC
Các dẫn chất sau khi khẳng định đƣợc độ tinh khiết và cấu trúc phù hợp với dự đoán đƣợc đem thử tác dụng sinh học. Hình 3.1 dƣới đây cho thấy kết quả của phƣơng pháp 1, phƣơng pháp gián tiếp xác định tác dụng ức chế HDAC theo phân tích dựa trên Western blot.
Các enzym HDAC điều khiển quá trình deacetyl hoá histon, do đó khả năng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp đƣợc sẽ đƣợc đánh giá dựa trên mức độ ức chế quá trình deacetyl hoá histon. Mức độ ức chế quá trình deacetyl hoá histon của các dẫn chất IVa-d ở nồng độ 3 μM đƣợc đánh giá dựa tr n phƣơng pháp Western Blot.
Hình 3.1: Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất IVa-d
Ghi chú: Dòng tế bào thử nghiệm: SW620; Nồng độ mẫu thử: 3 μM; Thời gian thử: 24 h.
VH: mẫu trắng; SAHA: acid suberoylanilid hydroxamic; GAPDH: glyceraldehyd 3-phosphat dehydrogenase (chất đảm bảo sự phân bố đồng nhất của các protein và kháng thể).
Trên hình ảnh điện di (hình 3.1), vết đậm của cả 4 dẫn chất IVa-d biểu thị sự có mặt của acetyl-histon H3 và acetyl-histon H4. Điều đó chứng tỏ các dẫn chất
IVa-d đã ức chế HDAC nên acetyl-histon H3 và acetyl-histon H4 không bị deacetyl hoá. Nhƣ vậy, cả 4 dẫn chất IVa-d đều làm cho hoạt tính enzym bị ức chế khi thử tại nồng độ 3 µM.
Để xác định rõ hơn tác dụng ức chế enzym HDAC, các dẫn chất IVa-d đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp 2, phƣơng pháp đánh giá trực tiếp bằng cách sử dụng bộ Kit định lƣợng Fluoregenic HDAC Assay Kit (BPS Bioscience). Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.8. Các dẫn chất tác dụng theo cơ chế phân tử, do đó để so sánh tác dụng ức chế HDAC giữa các dẫn chất, giá trị IC50 đƣợc quy đổi từ đơn vị µg/mL sang đơn vị µM.
Bảng 3.8: Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC2 của các dẫn chất IVa-d và SAHA
Chất R Tác dụng ức chế HDAC (IC50) 1 µg/mL µM IVa -H 0,055 0,160 IVb -Br 0,011 0,026 IVc -OCH3 0,045 0,120 IVd -NO2 0,029 0,080 SAHA2 0,053 0,200
Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym HDAC của 4 dẫn chất IVa-d đều cho thấy các dẫn chất có khả năng ức chế HDAC ở nồng độ dƣới 0,2 µM và đều có tác dụng tốt hơn SAHA hình 3.2).
Khi so sánh 4 dẫn chất với nhau, nhận thấy các dẫn chất IVb-d có giá trị IC50 nhỏ hơn dẫn chất IVa. Từ kết quả này có thể đƣa ra nhận xét: dẫn chất không nhóm thế IVa cho tác dụng ức chế HDAC yếu hơn các dẫn chất có nhóm thế ở vị trí 5 trên mạch vòng (IVb-d). Kết quả trên có thể gợi ý rằng sự có mặt nhóm thế ở vị trí 5 làm cho dẫn chất có cấu trúc không gian phù hợp hơn để tạo tƣơng tác giữa các chất ức chế HDAC và enzym so với khi không có nhóm thế.
Khi so sánh giữa các dẫn chất IVb-d có thể thấy:
- Dẫn chất IVc mang nhóm thế -OCH3có giá trị IC50 lớn hơn dẫn chất IVb
gắn -Br và IVd gắn -NO2. Nhƣ vậy có thể đƣa ra nhận định: ở vị trí 5 trên nhân indolin, nhóm thế hút điện tử (-Br, -NO2) (của IVb, IVd) làm tăng hoạt tính ức chế enzym HDAC so với nhóm thế đẩy điện tử (-OCH3) (của IVc).
- Bên cạnh đó có thể thấy dẫn chất IVb cho tác dụng ức chế HDAC lớn hơn hẳn dẫn chất IVd và mạnh nhất trong dãy IVa-d (giá trị IC50 củadẫn chất IVb nhỏ hơn 3 lần giá trị IC50 của dẫn chất IVd). Điều này có thể giả thiết là do trong không gian nhóm -NO2 của IVd có cấu trúc cồng kềnh hơn so với nhóm thế -Br của IVb, n n tƣơng tác của IVb với enzym HDAC mạnh hơn dẫn chất IVd, làm cho tác dụng ức chế HDAC của dẫn chất IVb tốt hơn nhiều so với dẫn chất IVd.
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
IVa IVb IVc IVd SAHA IC50
(µM)
Hình 3.2:Biểu đồ so sánh tác dụng ức chế HDAC2 của các dẫn chất IVa-d với SAHA
Nhƣ vậy, cả 4 dẫn chất IVa-d đều có tác dụng ức chế HDAC dƣới 0,2 µM, trong đó dẫn chất IVb có khả năng ức chế mạnh hơn cả, tiếp đó là dẫn chất IVd; dẫn chất IVa và IVc cho tác dụng yếu nhất, nhƣng vẫn mạnh hơn SAHA.