Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2.1.Thử tác dụng ức chế HDAC
Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp đƣợc đánh giá bằng hai phƣơng pháp:
a. Phương pháp 1: Phân tích Western blot
Đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong tế bào ung thƣ đại tràng (SW620). Phân tích dựa trên Western blot có thể khẳng định đƣợc tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng [2].
b. Phương pháp 2: Phương pháp huỳnh quang
Đánh giá trực tiếp bằng cách sử dụng bộ Kit định lƣợng Fluoregenic HDAC Assay Kit (BPS Bioscience), trong đó enzym HDAC2 đƣợc cung cấp bởi BPS Bioscience (San Diego, CA, USA).
Các bƣớc tiến hành đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của bộ Kit thử nghiệm [35]: - Chuẩn bị mẫu thử:
+ Pha loãng Trichostatin A 200 µM bằng dung dịch đệm (HDAC assay buffer) để thu đƣợc dung dịch có nồng độ 20 µM.
+ Pha loãng cơ chất HDAC từ nồng độ 5 mM thành dung dịch có nồng độ 200 µM bằng dung dịch đệm (HDAC assay buffer).
+ Pha loãng HDAC2 trong dung dịch đệm HDAC assay buffer để thu đƣợc dung dịch có nồng độ 1 ng/µL.
+ Bƣớc 1: Trộn hỗn hợp các chất phản ứng trong đĩa vi chuẩn màu đen (microtiter black plate) theo bảng dƣới đây. Ủ ấm ở 37oC trong 30 phút. Thí nghiệm đƣợc tiến hành 2 lần.
Bảng 2.1: Pha mẫu thí nghiệm định lƣợng HDAC2
Chứng (+) Chứng (-) Chất thử Trắng (-) HDAC2 (1 ng/µL) 5 µL 5 µL 5 µL - Cơ chất HDAC (200 µM) 5 µL 5 µL 5 µL 5 µL BSA (1 mg/mL) 5 µL 5 µL 5 µL 5 µL Trichostatin A - 5 µL - - Chất thử - - 5 µL - Đệm ức chế (không có chất ức chế) 5 µL - - 5 µL
Dung dịch đệm (HDAC assay buffer)
30 µL 30 µL 30 µL 35 µL
Tổng 50 µL 50 µL 50 µL 50 µL
+ Bƣớc 2: Thêm 50 µL HDAc assay developer (2x) vào mỗi lô. Để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
+ Bƣớc 3: Đọc kết quả độ hấp thụ tr n máy đo hấp thụ huỳnh quang, tại bƣớc sóng kích thích 350-360 nm và bƣớc sóng phát quang 440-460 nm độ hấp thụ đƣợc đo 2 lần ở mõi bƣớc sóng).
Kết quả độ hấp thụ (của 2 lần thí nghiệm đƣợc đƣa vào phần mềm excel tính toán để thu đƣợc phần trăm trung bình mẫu thử gắn với HDAC. Phần trăm này đƣợc chuyển sang phần mềm GraphPad prism để tính toán ra IC50. Độ lệch chuẩn tƣơng đối không quá 10 %.