Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2.2. Thử độc tính tế bào
Thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ thử độc tính tế bào) in vitro đƣợc thực hiện tại hoa Dƣợc, trƣờng Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phƣơng pháp Sulforhodamin B (SRB). Giá trị IC50 đƣợc tính dựa tr n phƣơng pháp Probits [5,13].
Dòng tế bào thử nghiệm: SW620 (tế bào ung thƣ đại tràng), PC-3 (tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến) và AsPC-1 (tế bào ung thƣ tuyến tuỵ).
Các tế bào ung thƣ đƣợc lấy từ Ngân hàng tế bào ung thƣ của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng RPMI bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò).
* Nguyên tắc thử
Dựa trên khả năng gắn của thuốc nhuộm với các acid amin cơ bản của protein trong tế bào, sử dụng phƣơng pháp đo màu để tính tổng lƣợng protein, từ đó suy ra số lƣợng tế bào.
Ƣu điểm của phƣơng pháp này so với các phƣơng pháp khác bao gồm: độ nhạy tốt, độ tuyến tính cao, điểm kết thúc ổn định và không yêu cầu độ chính xác về thời gian, giá thành thấp.
Nhƣợc điểm của phƣơng pháp này nằm ở bƣớc th m TCA để cố định tế bào. Nếu TCA không đƣợc thêm vào từ từ, nhẹ nhàng, TCA có thể làm vỡ tế bào trƣớc khi tế bào đƣợc cố định, làm giải phóng các thành phần có thể làm ảnh hƣởng đến kết quả định lƣợng.
* Các bước tiến hành:
Bƣớc 1: Chuẩn bị tế bào đĩa A
- Nuôi cấy các dòng tế bào trong môi trƣờng RPMI 1640 với 10% FBS, 1% glutamin và 1% penicillin/ streptomycin (100 U/mL nấm Penicilium và 100 μg/mL streptomycin) hoặc các môi trƣờng phù hợp khác.
- Sử dụng các tế bào đang ở pha logarit (300-500.103 tế bào/mL) hoặc đƣợc trypsin hoá (với các dòng tế bào bám dính).
- Phân tán 100 000 tế bào vào 10 mL môi trƣờng RPMI 1640 với 20% FBS, 1% glutamin và 1% pen/ strep.
- Từ 100 000 tế bào trong 10 mL môi trƣờng, dùng pipet hút 100 μL hỗn dịch tế bào và môi trƣờng vào mỗi giếng để có 1000 tế bào ở mỗi giếng.
- Hàng đầu ti n đƣợc sử dụng làm mẫu trắng, hàng tiếp theo là các mẫu đối chứng (không có mẫu thử).
- Để yên trong một giờ trƣớc khi thêm thuốc vào nghiên cứu nhằm kết dính các tế bào.
Bƣớc 2: Chuẩn bị mẫu đĩa B
- Dùng pipet th m 125 μL môi trƣờng RPMI 1640 vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng. - Thêm 125 μL mẫu thử vào mỗi giếng ở hàng đầu tiên, trộn đều, sau đó lấy 125 μL hỗn hợp ở hàng đầu tiên thêm vào các giếng ở hàng thứ hai, lặp lại quá trình này cho đến hàng cuối cùng để có đƣợc các nồng độ pha loãng.
- Hút 100 μL từ hàng thứ 10 của đĩa B th m vào hàng cuối cùng của đĩa A để dung dịch nồng độ nhỏ hơn ít ảnh hƣởng đến nồng độ dung dịch đƣợc hút ở các lần tiếp theo), lần lƣợt nhƣ vậy cho đến hàng thứ 3 của đĩa A.
- Th m 100 μL môi trƣờng RPMI 1640 (không chứa mẫu thử) vào hàng mẫu đối chứng để đƣợc 200 μL hỗn dịch với 10% FBS trong mỗi giếng.
- Th m 200 μL môi trƣờng vào hàng mẫu trắng. - Ủ trong 48 giờ.
Bƣớc 3: Tiến hành thử
- Chuẩn bị dung dịch gốc 50% TCA, làm lạnh ở 4oC rồi th m 50 μL dung dịch đã làm lạnh vào mỗi giếng chứa 200 μL hỗn dịch tế bào và môi trƣờng để tạo nồng độ 10% TCA ở mỗi giếng.
- Đặt đĩa 96 giếng ở 4oC trong 1 giờ để cố định tế bào.
- Chuẩn bị dung dịch 0,4% SRB (kl/tt) trong 1% acid acetic và thêm 70 μL dung dịch này vào mỗi giếng, để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
- Rửa đĩa với 1% acid acetic 5 lần để rửa trôi lƣợng SRB chƣa gắn.
- Chuẩn bị dung dịch gốc 10 mM tris(hydroxymethyl) aminomethan (base Trizma) và thêm 200 μL dung dịch này vào mỗi giếng để hoà tan các SRB đã gắn. Đặt đĩa 96 giếng vào máy lắc trong ít nhất 10 phút.
- Đọc độ hấp thụ ở 492 nm với các đĩa vi thể (microplate), loại trừ độ hấp thụ của nền đĩa microplate ở bƣớc sóng 620 nm.
* Tính kết quả
Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó độ hấp thụ giảm đi 50% so với mẫu đối chứng (trắng âm tính là giếng chỉ th m môi trƣờng nuôi cấy), kết quả cuối
cùng là giá trị trung bình của 3 lần đo độc lập với độ sai khác không quá 5%. Giá trị IC50 đƣợc tính dựa theo phƣơng pháp Probits.
2.3.3. Đánh giá mức độ giống thuốc của các dẫn chất tổng hợp đƣợc
Tính giá trị logP của các chất tổng hợp bằng phần mềm EPIsuite cung cấp bởi US Environmental Protection Agency's Office of Pollution Prevention Toxics and Syracuse Research Corporation (SRC). Quy trình bao gồm vẽ cấu trúc 2D, tạo Smile notation bằng phần mềm ChemSketch 4.0 của ACD labs sau đó đƣa Smile notation vào phần mềm EPIsuite để tính các giá trị logP.
Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất dựa trên quy tắc Lipinsky [17]: + Khối lƣợng phân tử của chất không lớn hơn 500 g/mol.
+ Số trung tâm nhận liên kết hydro (N, O) không lớn hơn 10. + Số trung tâm cho liên kết hydro (NH, OH) không lớn hơn 5. + Giá trị logP của chất không lớn hơn 5.