3.VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.6.2. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
3.6.2.1. Phương pháp hấp khử trùng dụng cụ
Các dụng cụ bằng thuỷ tinh như ống nghiệm, bình tam giác, hộp petri được khử trùng bằng hơi nóng ở nhiệt độ 1600C trong 3 giờ bằng tủ sấy.
Dao, kẹp, que cấy được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn.
Môi trường nuôi cấy được khử trùng bằng hơi nước nóng ởđiều kiện nhiệt
độ 1210C, 1.5 atm từ 40- 45 phút trong nồi hấp.
3.6.2.2 Phương pháp chế tạo môi trường
Các môi trường dùng trong thí nghiệm: WA, PGA, CA, PCA, CMA.
* Môi trường WA (Water- Agar): - Thành phần:
Agar : 20 g Nước cất : 1000 ml
- Phương pháp điều chế: Thạch được hoà tan trong môi trường nước đã đun sôi và hấp vô trùng trong điều kiện 1210C; 1,5 atm trong thời gian 30 - 45 phút. Môi trường sau khi hấp để nguội 30 phút rồi chia ra các hộp petri.
- Công dụng: Môi trường WA là môi trường nghèo dinh dưỡng, ít bị lẫn tạp dùng để cấy đơn bào tử và để cấy đỉnh sinh trưởng của sợi nấm, được sử dụng để
phân lập nấm ban đầu từ mô bệnh.
* Môi trường PGA (Potato- Glucose- Agar): - Thành phần:
Khoai tây : 250 g
Đường glucose : 20 g Agar : 20 g Nước cất : 1000 ml
- Phương pháp điều chế: Chọn những củ khoai tây không bị sâu bệnh, không cần gọt vỏ, chỉ cần rửa sạch cân lấy 250 g, sau đó cắt thành từng lát mỏng, miếng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 16
vuông khoảng 1cm2 cho vào nồi và đổ nước cất đun sôi 30 phút đến khi khoai chín mềm. Dùng vải màn sạch lọc lấy dịch nước khoai tây đổ vào bình tam giác, sau đó thêm nước cất đến thể tích 1000 ml là được. Cho thêm 20 g đường và 20 g agar vào bình tam giác, khuấy đều bằng đũa thuỷ tinh, hoà tan bằng lò vi sóng. Rồi cho bình
đựng môi trường vào nồi hấp, hấp khử trùng 1210C (1,5 atm) trong 30 - 45 phút, để
nguội 30 phút rồi đổ vào các hộp petri đã được khử trùng 1600C trong 2 giờ.
- Công dụng: Môi trường PGA dùng để nuôi cấy nấm đã phân lập từ môi trường WA làm nấm thuần để giữ nguồn, nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh học của nấm.
* Môi trường CA (Carott- Agar): - Thành phần:
Carott : 200 g Agar : 20 g Nước cất : 1000 ml
- Phương pháp điều chế: Tương tự như môi trường PGA.
- Công dụng: Dùng để nuôi cấy nấm đã phân lập từ môi trường WA nhằm nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học của nấm.
* Môi trường PCA (Potato- Carott- Agar): - Thành phần:
Khoai tây : 20 g Carott : 20 g Agar : 20 g Nước cất : 1000 ml
- Phương pháp điều chế: Tương tự như môi trường PGA.
- Công dụng: Môi trường PCA dùng để nuôi cấy nấm đã phân lập từ môi trường WA nhằm nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học của nấm.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 17
* Môi trường CMA (Corn meal - Agar): - Thành phần:
Bột ngô : 30 g Agar : 20 g Nước cất : 1000 ml
- Phương pháp điều chế: Tương tự như môi trường PGA.
- Công dụng: Môi trường CMA dùng để nuôi cấy nấm đã phân lập từ môi trường WA nhằm nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học của nấm.
3.6.2.3. Phương pháp phân lập
* Phương pháp lấy mẫu: Rửa sạch mẫu bệnh bằng nước máy, rửa sạch cho hết bụi bẩn và các tàn dư khác bám vào, sau đó rử sạch bằng nước cất. Cắt mô bệnh thành những miếng cắt có cả mô bệnh và mô khoẻ. Khử trùng bề mặt bằng cồn 700 trong thời gian 30 phút, sau đó rử sạch bằng nước cất để loại bỏ hết cồn. Thấm khô miếng cắt bằng giấy vô trùng, dùng dao khử trùng cắt mẫu mô bệnh thành các miếng nhỏ có kích thước 5x 5 mm. Đặt các mô bệnh vào môi trường WA. Để các
đĩa môi trường lên giá.
* Cách phân lập mẫu bệnh: Mẫu bệnh hại cà chua sau khi thu thập ngoài
đồng ruộng, rửa sạch bằng nước cất. Dùng giấy thấm khô, cắt mẫu bệnh, cắt giữa mô bệnh và mô khoẻ (cắt 2- 3 cm). Đặt mẫu bệnh vào cồn sát trùng, thấm khô bằng giấy vô trùng, dùng que cấy đã khử trùng cấy mẫu bệnh vào giữa đĩa petri có thấm giấy vô trùng. Sau 1- 2 ngày sợi nấm mọc ra, cấy truyền sợi nấm sang hộp petri khác cho đến khi nhận được nấm thuần.
Quan sát đặc điểm hình thái, màu sắc sợi nấm. Khi đã có tản nấm, nấm và bào tử nấm,chúng tôi tiến hành các thí nghiệm trong phòng.
Toàn bộ quá trình phân lập được thực hiện trong điều kiện vô trùng và cách ly
ởổ cấy (khi phân lập phải khử trùng que cấy và hé mởđĩa petri trên ngọn lửa đèn cồn).