Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: Cân số gam dược liệu đã được tán nhỏ thành bột tương ứng có trong 1g cao đặc.
Cụ thể: Đương quy 0,5g Câu kỷ tử 0,8g
Bá bệnh 0,7g Ba kích 0,5g
Hoàng kỳ 0,8g Bạch tật lê 0,7g Cốt khí củ 0,5g Xà sàng tử 0,5g - Cho riêng mỗi vị thuốc vào bình nón, ngâm trong ethanol 96%, 3 lần, mỗi lần 10ml trong 1 giờ, gạn lấy dịch, lọc, lấy dịch lọc đem bốc hơi dung môi còn 1ml để chấm sắc ký của từng vị thuốc.
- Lấy 1g cao đặc, ngâm trong 30ml ethanol 96% trong 3 giờ, lọc, lấy dịch lọc đem bốc hơi dung môi còn 1ml, được dịch chấm sắc ký của cao đặc.
- Bản mỏng Silicagel GF254 tráng sẵn, hoạt hóa ở 1050C trong 1 giờ.
- Hệ dung môi triển khai: Mỗi vị thuốc tiến hành khảo sát trên nhiều hệ dung môi, chon hệ tách vết rõ, có khả năng nhận biết được vị thuốc trong cao đặc bài thuốc để ghi lại kết quả.
3.2.2.1. Vị thuốc đương quy
- Dịch chấm sắc ký của vị thuốc (Đ)
- Dịch chấm sắc ký của cao đặc chiết ethanol 70% (C70) - Dịch chấm sắc ký của cao đặc chiết ethanol 40% (C40)
- Triển khai sắc ký: Chấm riêng 3 vết dịch chiết đương quy, cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40% trên cùng một bản mỏng với cùng một thể tích, để khô, chạy sắc ký đến vạch giới hạn dung môi (cách mép trên 0,5cm), lấy ra, để khô ở nhiệt độ phòng. Hiện vết dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254nm và 365nm.
Nhận xét: Trên sắc ký đồ của cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol
40% cho 10 vết trong đó có 3 vết có Rf tương đương với sắc ký đồ của đương quy. Sắc ký đồ hình 3.3, trang 32.
Sơ bộ nhận định trong cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40% có vị thuốc đương quy.
Hình 3.3.Sắc ký đồ đương quy Hình 3.4.Sắc ký đồ hoàng kỳ và cao đặc và cao đặc
3.2.2.2. Vị thuốc hoàng kỳ
-Tiến hành tương tự như đương quy (mục 3.2.2.1, trang 31) - Hệ dung môi khai triển: Cloroform : methanol (19:1)
Nhận xét: Sắc ký đồ của cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40% cho 11 vết trong đó có 3 vết có Rftương đương với sắc ký đồ của hoàng kỳ. Sắc ký đồ hình 3.4, trang 32.
Sơ bộ nhận định trong cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40% có vị thuốc hoàng kỳ.
Hình 3.5.Sắc kỳ đồ cốt khí củ Hình 3.6. Sắc ký đồ ba kích và cao đặc và cao đặc
3.2.2.3. Vị thuốc cốt khí củ
- Tiến hành tương tự như đương quy (mục 3.2.2.1, trang 31) - Hệ dung môi khai triển: Toluen : chloroform : aceton (4:2,5:3,5)
Nhận xét: Sắc ký đồ của cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40% cho 8 vết trong đó có 3 vết có Rf tương đương với sắc ký đồ của cốt khí củ. Sắc ký đồ hình 3.5, trang 33.
Sơ bộ nhận định trong cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40% có vị thuốc cốt khí củ.
- Tiến hành tương tự như đương quy (mục 3.2.2.1, trang 31)
- Hệ dung môi khai triển: Toluen : ethylacetat : acid formic (8:2:0,1)
Nhận xét: Sắc ký đồ của cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40% cho 9 vết trong đó có 3 vết có Rf tương đương với sắc ký đồ của ba kích. Sắc ký đồ hình 3.6, trang 33.
Sơ bộ nhận định trong cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40% có vị thuốc ba kích.
Hình 3.7.Sắc ký đồ xà sàng tử Hình 3.8.Sắc ký đồ câu kỷ tử và cao đặc và cao đặc
3.2.2.5. Vị thuốc xà sàng tử
- Tiến hành tương tự như đương quy (mục 3.2.2.1, trang 31) - Hệ dung môi khai triển: Cloroform : ethylacetat (9:1)
Nhận xét: Sắc ký đồ của cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40% cho 11 vết trong đó có 4 vết có Rf tương đương với sắc ký đồ của xà sàng tử. Sắc ký đồ hình 3.7, trang 34.
Sơ bộ nhận định trong cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40% có vị thuốc xà sàng tử.
3.2.2.6. Vị thuốc câu kỷ tử
- Tiến hành tương tự như đương quy (mục 3.2.2.1, trang 31)
- Hệ dung môi khai triển: Toluen : ethylacetat : aceton : acid formic (5:2:2:1)
Nhận xét: Sắc ký đồ của cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40% cho 10 vết trong đó có 3 vết có Rf tương đương với sắc ký đồ của câu kỷ tử. Sắc ký dồ hình 3.8, trang 34.
Sơ bộ nhận định trong cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40% có vị thuốc câu kỷ tử.
Hình 3.9Sắc ký đồ bạch tật lê Hình 3.10. Sắc ký đồ bá bệnh và cao đặc và cao đặc
3.2.2.7. Vị thuốc bạch tật lê
- Tiến hành tương tự như đương quy (mục 3.2.2.1, trang 31) - Hệ dung môi khai triển: Cloroform : methanol (19:1)
Nhận xét: Sắc ký đồ của cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40% cho 9 vết trong đó có 5 vết có Rf tương đương với sắc ký đồ của bạch tật lê. Sắc ký đồ hình 3.9, trang 35.
Sơ bộ nhận định trong cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40% có vị thuốc bạch tật lê.
3.2.2.8. Vị thuốc bá bệnh
- Tiến hành tương tự như đương quy (mục 3.2.2.1, trang 31) - Hệ dung môi khai triển: Cloroform : ethylacetat (7:3)
Nhận xét: Sắc ký đồ của cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40% cho 7 vết trong đó có 3 vết có Rf tương đương với sắc ký đồ của bá bệnh. Sắc ký đồ hình 3.10, trang 35.
Sơ bộ nhận định trong cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40% có vị thuốc bá bệnh.
3.2.3. Định lượng flavonoid toàn phần
Tiến hành:theo phương pháp cân:
Lấy chính xác 5,00g cao đặc, hòa tan trong 25ml nước, cho vào bình gạn, lắc với ether dầu hỏa 3 lần, mỗi lần 15ml để loại tạp. Đun nóng đuổi hết ether dầu hỏa, chiết với ethyl acetat nhiều lần cho đến khi dịch chiết trong suốt. Gộp các dịch chiết ethyl acetat lại, cô trên bếp cách thủy đến cắn, đem sấy khô ở 800C tới khối lượng không đổi, cân. Làm 3 lần để lấy kết quả trung bình.
Công thức tính hàm lượng flavonoid trong cao đặc: X =m.(100 - H)(b - mc).104
Trong đó: X: Hàm lượng flavonoid trong cao đặc (%) b: Tổng khối lượng cắn và cốc (g)
mc: Khối lượng cốc (g)
m: Khối lượng cao đem thử (g) H: Hàm ẩm của cao (%)
Bảng 5.Kết quả định lượng flavonoid trong cao đặc chiết ethanol 70% Mẫu m (g) mc(g) b (g) H (%) X (%) 1 5,0281 106,2196 106,3562 14,04 3,16 2 5,0792 105,2387 105,3839 14,04 3,33 3 5,0174 107,4826 107,6346 14,04 3,52 TB 3,34
Nhận xét: Cao đặc chiết ethanol 70% có hàm lượng flavonoid toàn phần là 3,34%. Bảng 6.Kết quả định lượng flavonoid trong cao đặc chiết ethanol 40%
Mẫu m (g) mc(g) b (g) H (%) X (%)
1 5,1615 113,9476 114,0628 14,03 2,60
2 5,0348 106,4857 106,6022 14,03 2,69
3 5,1049 107,5142 107,6298 14,03 2,63
TB 2,64
Nhận xét:Cao đặc chiết ethanol 40% có hàm lượng flavonoid toàn phần là 2,64%.
3.2.4. Xác định các chỉ tiêu hóa lý 3.2.4.1. Xác định độ ẩm
Xác định độ ẩm của cao đặc theo phương pháp cất với dung môi.
Tiến hành:
Rửa sạch ống hứng và ống sinh hàn với nước rồi sấy khô. Thêm 200ml toluen và khoảng 2ml nước vào bình cầu khô. Cất khoảng 2h, để nguội trong 30 phút, đọc thể tích nước cất được ở ống hứng (V1).
Thêm vào bình cầu 1 lượng cao đặc đã cân chính xác tới 0,01g chứa khoảng 2ml nước. Thêm vài mảnh đá bọt. Cất đến khi mực nước cất được trong ống hứng không đổi, dùng 5 – 10 ml toluen rửa thành trong ống sinh hàn, cất thêm 5 phút nữa. Để nguội, dùng 5 ml toluen để kéo những giọt nước còn đọng trên thành ống sinh hàn (nếu có) xuống. Khi phân lớp hoàn toàn, đọc thể tích nước trên ống hứng (V2). Làm 3 mẫu để lấy kết quả trung bình.
Độ ẩm của cao được tính theo công thức (1), trang 16.
Yêu cầu:Không quá 20%
Bảng 7:Kết quả xác định độ ẩm của cao đặc chiết ethanol 70% Mẫu m (g) V1(ml) V2(ml) H (%) 1 3,9602 2,00 2,40 10,10 2 4,0038 2,00 2,60 14,99 3 4,1042 2,00 2,70 17,05 TB 14,04
Nhận xét:Độ ẩm của cao là 14,04% đạt tiêu chuẩn cao đặc của DĐVN IV. Bảng 8:Kết quả xác định độ ẩm của cao đặc chiết ethanol 40%
Mẫu m (g) V1(ml) V2(ml) H (%)
1 3,9878 2,00 2,50 12,54
2 4,0089 2,00 2,60 14,97
3 4,1087 2,00 2,60 14,60
TB 14,03
Nhận xét:Độ ẩm của cao là 14,03% đạt tiêu chuẩn cao đặc của DĐVN IV.
3.2.4.2. Mô tả
- Cao đặc chiết ethanol 70%: Thể chất mềm, đồng nhất, màu nâu đen, mùi thơm, vị hơi ngọt.
- Cao đặc chiết ethanol 40%: Thể chất mềm, đồng nhất, màu nâu đen, mùi thơm, vị hơi ngọt.
3.2.4.3. Xác định pH
Tiến hành: Pha thành dung dịch cao đặc 1% (kl/tt): cân chính xác 1g cao đặc bài thuốc cho vào cốc có mỏ, hòa tan, chuyển dần cao ở trong cốc bằng nước cất vào bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch. Hiệu chuẩn máy đo pH lần lượt bằng các dung dịch đệm chuẩn có pH = 7, pH = 10, pH = 4. Nhúng điện cực vào dung dịch cao đặc 1% và đo trị số pH ở cùng điều kiện đo của các dung dịch đệm chuẩn khi hiệu chuẩn máy. Làm 3 mẫu, lấy kết quả trung bình.
Bảng 9:Độ pH của cao đặc chiết ethanol 70% Mẫu m (g) pH 1 1,0121 4,47 2 1,0037 4,44 3 1,0028 4,42 TB 4,44
Nhận xét:Cao đặc chiết ethanol 70% có tính acid. Bảng 10.Độ pH của cao đặc chiết ethanol 40%
Mẫu m (g) pH
1 1,0668 4,37
2 1,0039 4,36
3 1,0659 4,37
TB 4,37
Nhận xét:Cao đặc chiết ethanol 40% có tính acid.
3.2.4.4. Xác định chất chiết được bằng nước
Tiến hành: Cân chính xác 4,000g cao cho vào bình nón 250ml. Thêm chính xác 100ml nước, đậy kín, ngâm lạnh, thỉnh thoảng lắc tong 6h đầu, để yên 18h. Lọc qua phễu lọc khô vào 1 binh hứng khô thích hợp. Lấy chính xác 20ml dịch lọc cho vào 1 cốc thủy tinh đã cân bì trước. Cô cách thủy đến cắn khô, sấy cắn ở 1050C trong vòng 3h. Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30 phút, cân nhanh xác định khối lượng cắn sau khi sấy. Làm 3 mẫu để tính kết quả trung bình.
Hàm lượng chất chiết được bằng nước tính theo công thức (2), trang 17.
Kết quả:Ghi ở bảng 11, bảng 12.
Bảng 11:Hàm lượng chất chiết được bằng nước trong cao đặc chiết ethanol 70%.
Mẫu m(g) m1(g) m2(g) C(%)
1 4,1065 104,5402 104,8008 36,91
2 4,0700 109,8595 110,1033 34,84
3 4,0392 102,6289 102,8868 37,14
TB 36,30
Nhận xét:Hàm lượng chất chiết được bằng nước trong cao đặc chiết ethanol 70% là 36,30%.
Bảng 12:Hàm lượng chất chiết được bằng nước trong cao đặc chiết ethanol 40%. Mẫu m (g) m1(g) m2(g) C (%) 1 4,3207 106,7210 107,2144 66,42 2 4,5055 99,1367 99,7187 75,13 3 4,4157 106,2808 106,7646 63,72 TB 68,42
Nhận xét:Hàm lượng chất chiết được bằng nước trong cao đặc chiết ethanol 40% là 68,42%.
3.2.2.5. Xác định tro toàn phần của cao đặc
Tiến hành:Cho chính xác khoảng 2,0000g cao đặc vào 1 chén sứ đã nung và cân bì. Nung ở nhiệt độ không quá 4500C tới khi không còn carbon, làm nguội rồi cân. Tính tỷ lệ phần trăm của tro toàn phần theo cao khô kiệt theo công thức:
T =100.100.(mm.(100 - H)t+c -mc) Trong đó: T: tỷ lệ phần trăm của tro toàn phần (%)
mt+c: tổng khối lượng chén sứ và tro toàn phần (g) mc: khối lượng chén sứ (g)
m: khối lượng cao đem thử (g) H: độ ẩm cao (%)
Kết quả: ghi ở bảng 13, bảng 14.
Bảng 13.Kết quả xác định tro toàn phần của cao đặc chiết ethanol 70%
Mẫu mt+c(g) mc(g) m (g) H (%) T (%) 1 22,5440 22,4392 2,1458 14,04 5,68 2 22,5459 22,4465 2,5294 14,04 4,57 3 20,8607 20,7643 2,0264 14,04 5,53
TB 5,26
Bảng 14.Kết quả xác định tro toàn phần của cao đặc chiết ethanol 40% Mẫu mt+c(g) mc(g) m (g) H (%) T (%) 1 20,9027 20,7653 2,0544 14,03 7,78 2 20,9100 20,7668 2,0912 14,03 7,97 3 21,2914 21,1586 2,0735 14,03 7,45 TB 7,73
Nhận xét:Tỷ lệ phần trăm tro toàn phần của cao đặc chiết ethanol 40% là 7,73%