3.2.1.1. Định tính flavonoid
Chiết xuất: Hòa tan 2g cao đặc vào 10ml nước cất, đun nóng nhẹ cho tan, lọc (gấp nếp). Lắc với ether dầu hỏa 3 lần, mỗi lần với 10ml để loại tạp. Lấy lớp nước, đem lắc với ethyl acetat 3 lần, mỗi lần 10ml. Gộp dịch chiết ethyl acetat, bốc hơi dung môi đến cắn, hòa tan cắn vào 10ml ethanol 90% được dịch chiết để làm phản ứng định tính.
Định tính:
a. Phản ứng với dung dịch kiềm loãng
Tiến hành: Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 3 giọt NaOH 10%, lắc kỹ. Phản ứng dương tính khi màu vàng của dung dịch tăng lên rõ rệt.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 70%: dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ cam (phản ứng dương tính).
- Cao đặc chiết ethanol 40%: dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu da cam (phản ứng dương tính).
b. Phản ứng với hơi NH3
Tiến hành: Nhỏ 2 giọt dịch chiết lên 2 vị trí khác nhau của giấy lọc, để khô, 1 vết che kín, 1 vết hơ trên miệng lọ chứa NH3đặc. Phản ứng dương tính khi vết được hơ có màu vàng tăng lên.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 70%: vết được hơ có màu da cam nhạt (phản ứng dương tính).
- Cao đặc chiết ethanol 40%: vết được hơ có màu da cam (phản ứng dương tính).
c. Phản ứng với dung dịch FeCl35%
Tiến hành: Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2 giọt FeCl3 5%, lắc đều. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu xanh đen.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 70%: dung dịch chuyển từ màu vàng sang xanh đen (phản ứng dương tính).
- Cao đặc chiết ethanol 40%: dung dịch chuyển từ màu vàng sang xanh nhạt (phản ứng dương tính).
d. Phản ứng Cyanidin
Tiến hành: Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 1 ít bột magie, nhỏ từ từ 3 giọt HCl đặc, đun nóng cách thủy. Phản ứng dương tính nếu có màu từ vàng, đỏ đến xanh lá.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 70%: dung dịch chuyển từ màu vàng → đỏ → xanh đen (đun cách thủy khoảng 10 phút mới chuyển màu rõ). Phản ứng dương tính.
- Cao đặc chiết ethanol 40%: dung dịch chuyển từ màu vàng sang đỏ (phản ứng dương tính).
e. Phản ứng diazo hóa
Tiến hành:Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2ml dung dịch NaOH, thêm 3 giọt TT diazoni, lắc đều, đun nóng cách thủy trong vài phút. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu hồng, đỏ, đỏ cam.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 70%: dung dịch chuyển từ màu vàng → hồng → đỏ cam (phản ứng dương tính).
- Cao đặc chiết ethanol 40%: dung dịch chuyển từ màu vàng → hồng nhạt → đỏ cam (phản ứng dương tính).
Nhận xét:Qua các phản ứng trên sơ bộ nhận định cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40% có flavonoid.
3.2.1.2. Định tính saponin
Chiết xuất:Hòa tan 2g cao đặc vào 10ml nước, đun nóng nhẹ cho tan hết. Để nguội, lắc với ether dầu hỏa 3 lần, mỗi lần 10ml để loại tạp, lấy lớp nước, đun nóng để đuổi hết ether dầu hỏa. Chiết với n – butanol 3 lần, mỗi lần 10ml. Gộp các dịch chiết n – butanol lại, bốc hơi dung môi đến cắn, hòa tan cắn vào 10ml ethanol 90% được dịch chiết để làm phản ứng định tính.
Định tính:
a. Quan sát hiện tượng tạo bọt
Tiến hành: Lấy 1g cao đặc, thêm 10ml nước cất, đun cách thủy cho tan hết, để nguội, lắc mạnh theo chiều dọc ống trong vòng 5 phút. Phản ứng dương tính nếu cột bọt bền sau 15 phút.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 70%: sau 15 phút cột bọt vẫn bền vững (phản ứng dương tính).
- Cao đặc chiết ethanol 40%: sau 15 phút cột bọt vẫn bền vững (phản ứng dương tính).
b. Phản ứng Liebermann – Burchardt
Tiến hành: Lấy 1ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, bốc hơi đến cắn, hòa tan cắn trong 1ml anhydride acetic, thêm 1 giọt H2SO4 đặc. Phản ứng dương tính khi: cho màu xanh lá (dẫn chất steroid), màu đỏ (dẫn chất triterpenoid).
-Cao đặc chiết ethanol 70%: dung dịch chuyển từ màu vàng sang đỏ sẫm (phản ứng dương tính).
-Cao đặc chiết ethanol 40%: dung dịch chuyển từ màu vàng sang đỏ sẫm (phản ứng dương tính).
c. Phản ứng Salkowski
Tiến hành: Lấy 1ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, bốc hơi tới cắn. Hòa tan cắn bằng 1ml Cloroform, thêm 1 giọt H2SO4đặc. Phản ứng dương tính nếu có màu vàng chuyển sang đỏ sẫm hay xanh, xanh tím.
Kết quả:
-Cao đặc chiết ethanol 70%: dung dịch chuyển từ màu vàng sang đỏ sẫm (phản ứng dương tính).
-Cao đặc chiết ethanol 40%: dung dịch chuyển từ màu vàng sang đỏ sẫm (phản ứng dương tính).
d. Phản ứng sơ bộ phân biệt 2 loại Saponin
Tiến hành:
- Lấy 2 ống nghiệm dung tích 20ml, cho 5ml NaOH 0,1N vào ống 1 và 5ml HCl 0,1N vào ống nghiệm 2.
- Cho vào mỗi ống nghiệm 2 – 3 giọt dịch chiết. Lắc mạnh cả 2 ống trong 3 phút. Để yên, quan sát cột bọt.
- Nếu cột bọt ở ống 1 cao gấp 2 – 3 lần cột bọt ở ống 2 thì sơ bộ kết luận có saponin steroid, nếu cột bọt ở 2 ống bằng nhau thì sơ bộ kết luận có saponin triterpenoid.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 70%: cột bọt ở 2 ống bằng nhau (phản ứng dương tính) sơ bộ kết luận cao đặc có saponin triterpenoid.
- Cao đặc chiết ethanol 40%: cột bọt ở 2 ống bằng nhau (phản ứng dương tính) sơ bộ kết luận cao đặc có saponin triterpenoid.
Nhận xét:Qua các phản ứng trên sơ bộ nhận định cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40% có saponin.
Hình 3.2.Sơ đồ bào chế cao đặc chiết ethanol 40% 4:1
3.2.1.3. Định tính alcaloid
Chiết xuất: Lấy 2g cao đặc hòa tan với 10ml nước, đun nóng nhẹ cho tan hết, lọc. Thêm amoniac đến pH = 8 – 9. Lắc tiếp với cloroform 3 lần, mỗi lần 15ml thu được dịch chiết cloroform. Cô cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn trong 10ml H2SO4 1N được dịch chiết để làm phản ứng định tính.
Định tính:Lấy 3 ống nghiệm:
Ống 1: 2ml dịch chiết + 3 giọt TT Mayer Ống 2: 2ml dịch chiết + 3 giọt TT Dragendorff Ống 3: 2ml dịch chiết + 3 giọt TT Bouchardat
Phản ứng dương tính nếu: ống 1 xuất hiên kết tủa trắng hoặc vàng, ống 2 xuất hiện tủa đỏ cam, ống 3 xuất hiện tủa nâu.
Kết quả:
Dược liệu sau khi sấy
Chiết nóng bằng ethanol 40%
Dịch chiết ethanol
Lọc, cất thu hồi dung môi Dịch chiết sau thu hồi
dung môi
Cô cách thủy Cao đặc 4:1
Rửa sạch, thái phiến, sấy ở 700C
- Cao đặc chiết ethanol 70%: sau 1 thời gian cả 3 ống không xuất hiện kết tủa (phản ứng âm tính).
-Cao đặc chiết ethanol 40%: sau 1 thời gian cả 3 ống không xuất hiện kết tủa (phản ứng âm tính).
Nhận xét:Qua phản ứng trên sơ bộ nhận định cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40% không có alcaloid.
3.2.1.4. Định tính coumarin
Chiết xuất: Lấy 2g cao đặc cho vào cốc có mỏ, pha loãng bằng 50ml nước cất. Đun trên bếp cách thủy cho tan hết, để lắng, lọc. Dịch lọc đem lắc với ether dầu hỏa để loại tạp, lắc 3 lần, mỗi lần 15ml. Gộp các dịch chiết nước, bốc hơi dung môi, cắn thu được hòa tan trong 10ml ethanol (TT) để làm phản ứng định tính.
Định tính:
a. Phản ứng đóng mở vòng lacton
Tiến hành:Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2ml dịch chiết: Ống 1: Thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%
Ống 2: Để yên
Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi, để nguội, quan sát. Phản ứng dương tính nếu: ống 1 có tủa đục màu vàng, ống 2 không thay đổi.
Thêm vào cả 2 ống nghiệm, mỗi ống 2ml nước cất. Lắc đều, quan sát. Phản ứng dương tính nếu: ống 1 trong suốt, ống 2 có tủa đục.
Thêm vào ống 1 vài giọt HCl đặc. Phản ứng dương tính nếu ống 1 đục trở lại giống ống 2.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 70%: phản ứng âm tính. - Cao đặc chiết ethanol 40%: phản ứng âm tính.
b. Quan sát huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm
Tiến hành: Nhỏ 3 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, nhỏ tiếp 3 giọt dung dịch NaOH 10%, sấy nhẹ cho đến khô. Che 1 nửa diện tích bằng 1 mẩu kim loại, soi đèn tử
ngoại trong vài phút, bỏ miếng kim loại ra. Phản ứng dương tính nếu phần không bị che sáng hơn phần bị che và nếu tiếp tục chiếu sáng thấy phần bị che sáng dần lên bằng phần không bị che.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 70%: phản ứng âm tính. - Cao đặc chiết ethanol 40%: phản ứng âm tính.
Nhận xét:Qua phản ứng trên sơ bộ nhận định cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40% không có coumarin.
3.2.1.5. Định tính tanin
Tiến hành:
- Lấy khoảng 1,00g cao, cho thêm 20ml nước cất, đun sôi trong 2 phút. Để nguội, lọc. Dịch lọc được dùng để định tính.
- Lấy 2ml dịch lọc cho vào 3 ống nghiệm khác nhau để làm phản ứng: Ống 1: Thêm tiếp vài giọt dung dịch Gelatin 1%
Ống 2: Thêm tiếp vài giọt dung dịch FeCl35% Ống 3: Thêm tiếp vài giọt dung dịch Chì acetat 10%
Phản ứng dương tính nếu ống 1 xuất hiện tủa bông trắng, ống 2 xuất hiện màu hoặc tủa xanh đen, ống 3 xuất hiện tủa bông trắng.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 70%: ống 1 xuất hiện tủa bông trắng, ống 2 xuất hiện màu xanh đen, ống 3 sau vài phút xuất hiện tủa bông trắng (phản ứng dương tính).
- Cao đặc chiết ethanol 40%: ống 1 xuất hiện tủa bông trắng, ống 2 xuất hiện màu xanh đen, ống 3 xuất hiện tủa bông trắng ngay (phản ứng dương tính).
Nhận xét:Qua phản ứng trên sơ bộ nhận định cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40% có tanin.
3.2.1.6. Định tính anthranoid
Tiến hành:
- Lấy 1,00g cao đặc, hòa tan vào 20ml nước, đun nóng cho tan, lọc, thêm 10ml Cloroform, lắc nhẹ, loại bỏ lớp nước, lấy lớp chloroform làm phản ứng.
- Lấy 2ml dịch cloroform, thêm 2ml amoniac vào ống nghiệm, lắc nhẹ cho phân lớp, quan sát, sau đó cho thêm 2 giọt NaOH 10%, quan sát. Phản ứng dương tính nếu lớp amoniac có màu đỏ tăng lên khi cho NaOH 10%.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 70%: lớp amoniac có màu đỏ nhạt, hơi đục, màu đỏ tăng lên khi cho NaOH 10%, trong suốt (phản ứng dương tính).
- Cao đặc chiết ethanol 40%: lớp amoniac có màu hồng nhạt, trong suốt, có màu đỏ khi cho NaOH 10% (phản ứng dương tính).
Nhận xét: Qua phản ứng trên sơ bộ nhận định trong cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40% có anthranoid.
3.2.1.7. Định tính polysaccharid, định tính đường khử
Chiết xuất: Hòa tan 2g cao đặc trong 20mml nước nóng, để nguội, lọc. Dịch lọc được dùng để định tính.
a. Định tính polysaccharid
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 4ml dịch lọc và 4 giọt TT Lugol, lắc đều. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu xanh đen.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 70%: xuất hiện màu xanh đen (phản ứng dương tính) - Cao đặc chiết ethanol 40%: xuất hiện màu xanh đen (phản ứng dương tính)
Nhận xét: Qua phản ứng trên sơ bộ nhận định trong cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40% có polysaccharid.
b. Định tính đường khử
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 2ml dịch lọc và 1ml TT Fehling A, 1ml TT Fehling B, lắc đều, đun nóng cách thủy. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện kết tủa đỏ gạch.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 70%: dung dịch có màu xanh đậm, xuất hiện kết tủa đỏ gạch (phản ứng dương tính).
- Cao đặc chiết ethanol 40%: dung dịch có màu đỏ sẫm, xuất hiện kết tủa đỏ gạch (phản ứng dương tính).
Nhận xét: Qua phản ứng trên sơ bộ nhận định trong cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40% có đường khử.
3.2.1.8. Định tính acid hữu cơ
Tiến hành:Lấy 0,5g cao đặc, thêm 10ml nước, đun nóng cho tan, lọc. Thêm 1 ít bột Na2CO3, lắc nhẹ. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện bọt khí.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 70%: không xuất hiện bọt khí (phản ứng âm tính).
- Cao đặc chiết ethanol 40%: không xuất hiện bọt khí (phản ứng âm tính).
Nhận xét: Qua phản ứng trên sơ bộ nhận định trong cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40% không có acid hữu cơ.
3..2.1.9. Định tính acid amin
Chiết xuất: Hòa tan 2g cao đặc trong 10ml nước cất, lắc với ether dầu hỏa để loại tạp, thêm đồng lượng aceton lắc đều, để tủ lạnh 3 giờ, lọc lấy dịch lọc, loại màu bằng than hoạt, cô dịch lọc còn 5ml để làm phản ứng định tính.
Định tính: Lấy 2ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm 3 giọt TT Ninhydrin, đun cách thủy 2 – 3 phút. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu tím.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 70%: xuất hiện màu tím (phản ứng dương tính). - Cao đặc chiết ethanol 40%: xuất hiện màu tím (phản ứng dương tính).
Nhận xét: Qua phản ứng trên sơ bộ nhận định trong cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40% có acid amin.
Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40% được tóm tắt ở bảng 4.
Bảng 4. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40%
TT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận Cao đặc chiết ethanol 70% Cao đặc chiết ethanol 40% 1 Flavonoid
Phản ứng với kiềm loãng +++ ++
Có Phản ứng với hơi NH3 ++ ++ Phản ứng với FeCl35% +++ + Phản ứng Cyanidin +++ +++ Phản ứng diazo hóa + + 2 Saponin
Hiện tượng tạo bọt ++ ++
Có Phản ứng Liebermann-Burchardt +++ +++
Phản ứng Salkowski +++ +++
Phản ứng phân biệt 2 loại
saponin Saponintriterpenoid Saponintriterpenoid
3 Alcaloid Phản ứng với TT Mayer - - Không
Phản ứng với TT Dragendorff - - Phản ứng với TT Bouchardat - -
4 Coumarin Phản ứng đóng mở vòng lacton - - Không
Quan sát huỳnh quang - -
5 Tanin Phản ứng với Gelatin 1%Phản ứng với FeCl + + Có
35% +++ +++ Phản ứng với chì acetat + +++
6 Anthranoid Phản ứng với NaOH + + Có
7 Polysaccharid Phản ứng với TT Lugol + + Có
8 Đường khử Phản ứng với TT Fehling ++ +++ Có
9 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 - - Không
10 Acid amin Phản ứng với TT Ninhydrin +++ +++ Có Ghi chú: (-): Phản ứng âm tính
(+): Phản ứng dương tính (++): Phản ứng dương tính rõ (+++): Phản ứng dương tính rất rõ
Nhận xét: Cao đặc chiết ethanol 70% và cao đặc chiết ethanol 40% có chứa các nhóm chất: flavonoid, saponin, tanin, anthranoid, polysaccharid, đường khử, acid amin, không có alcaloid, coumarin, acid hữu cơ. Các nhóm chất này đều có mặt trong các vị thuốc của bài thuốc như:
- Flavonoid có trong bạch tật lê.
- Saponin có trong hoàng kỳ, bạch tật lê, bá bệnh. - Tanin có trong bạch tật lê.
- Anthranoid có trong cốt khí củ.
- Polysaccharid có trong hoàng kỳ, đương quy. - Đường khử có trong đương quy, hoàng kỳ, ba kích. - Acid amin có trong đương quy, hoàng kỳ.