Tách các thành phần kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng
Bản mỏng Silicagel F254 có kích thước thích hợp được hoạt hóa ở 110oC trong 30 phút. Dung môi được pha theo đúng tỷ lệ trong bình chạy sắc ký và để cho bão hòa trong 30 phút. Chấm dịch chiết lên bản mỏng bằng mao quản, sấy khô ở 40-50oC, cho bản mỏng đã chấm dịch chiết vào bình chạy. Khi dung môi chạy được khoảng ¾ chiều dài bản mỏng thì lấy ra, đánh dấu vị trí dung môi và để khô tự nhiên. Phát hiện sự có mặt kháng sinh bằng cách:
Soi đèn tử ngoại: Bản mỏng sắc ký được trộn với một chất huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại, nếu có vết xuất hiện vết thử sẽ có màu huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại.
Phương pháp hiện hình VSV: Đặt bản mỏng đã chạy sắc ký và sấy khô vào đĩa Petri vô trùng. Đổ môi trường đã cấy VSV kiểm định vào, ủ ở 37oC trong 18- 24h. Nếu có kháng sinh thì vòng vô khuẩn sẽ xuất hiện.
Phương pháp hiện màu hóa học: Bản mỏng sắc ký được phun thuốc thử hiện màu, sấy ở 60oC trong 10 phút, nếu có vết sẽ hiện màu.
Quan sát bằng mắt thường.
Đọc kết quả SKLM: tính Rf theo công thức:
Dv: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm vết,
Ddm: Khoảng cách vạch xuất phát đến vạch dung môi đánh dấu.
Tinh chế kháng sinh thô bằng phương pháp sắc ký cột
Chuẩn bị cột sắc ký: Cột sắc ký Ø= 1cm, dài 50cm. Hạt nhồi cột là Silicagel 60 F254 Merk cỡ hạt 0,04 – 0,063mm. Cân khoảng 6g hạt nhồi cột, hoạt hóa ở 110oC trong 30 phút, đem hòa thành hỗn dịch với hệ dung môi chạy cột và đưa lên cột. Chiều cao của lớp chất nhồi cột khoảng 15cm.
Đưa mẫu chạy sắc ký lên cột: Bột kháng sinh thô được hòa tan trong methanol rồi trộn với 1g Silicagel đã hoạt hóa, sấy khô ở 50 – 60oC. Cho lượng silicagel này lên cột, để ổn định trong 30 phút.
Chạy sắc ký: Pha hệ dung môi sau đó để bão hòa trong khoảng 30 phút. Cho dung môi chảy qua cột với tốc độ 0,5ml/ phút. Chuẩn bị các ống nghiệm khô, sạch, lấy khoảng 20-40 phân đoạn, mỗi phân đoạn 5ml.
Xác định các phân đoạn chứa kháng sinh: Hoạt tính kháng sinh được đánh giá bằng phương pháp khoanh giấy lọc trên VSV kiểm định. Các phân đoạn có hoạt tính KS tiến hành SKLM với hệ dung môi tách tốt nhất đã nghiên cứu trước. Phân đoạn chính là những phân đoạn có hoạt tính kháng sinh mạnh nhất và có cùng Rf. Các phân đoạn có cùng Rf được
gộp chung lại với nhau, rồi đem cô, kết tinh, sấy, cân và kiểm tra độ tinh khiết về mặt sắc ký.
2.3.8 Nghiên cứu cấu trúc phân tử kháng sinh bằng phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ tử ngoại (UV) và đo nhiệt độ nóng chảy.
Bột kháng sinh tinh khiết về mặt sắc ký được cân chính xác, đem đi đo phổ UV, phổ hồng ngoại, phổ khối và nhiệt độ nóng chảy. Dựa trên kết quả thu được ta dự đoán các nhóm chức và cấu trúc phân tử kháng sinh thu được.
Chương 3. KẾT QUẢ 3.1 Nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh
3.1.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên chủng Streptomyces 21.123
Từ chủng gốc Streptomyces 21.123, chúng tôi đã sàng lọc ngẫu nhiên trên môi trường phân lập MT1, thu được 35 dạng chủng và đem thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch với VSV kiểm định (B.subtilis và
P.mirabilis). Một số kết quả chính được trình bày ở bảng 3.1 dưới đây:
Dạng chủng B.subtilis P.mirabilis Dạng chủng B.subtilis P.mirabilis (mm) s (mm) s (mm) s (mm) s 1 26,44 1,17 24,21 1,21 12 25,56 0,80 22,96 0,27 2 25,79 1,51 23,91 0,72 13 25,01 0,86 23,16 0,64 3 26,49 1,43 24,09 1,57 14 28,05 0,52 26,01 0,47 4 26,31 0,60 23,98 0,16 15 11,31 0,81 10,13 0,59 5 27,01 0,38 24,05 1,55 16 26,02 1,27 23,28 0,39 6 27,91 0,36 25,28 0,79 17 27,75 1,90 24,98 0,55 7 26,88 0,26 23,90 1,23 18 23,79 0,99 21,11 0,34 8 25,65 0,06 21,23 0,78 19 27,25 0,49 25,78 0,69 9 26,73 0,53 22,78 1,12 20 27,92 0,80 26,31 1,03 10 26,25 0,20 23,24 0,78 21 27,19 0,52 23,13 0,12 11 26,31 0,34 24,16 0,91 22 26,81 0,33 25,29 1,05
Dựa vào kết quả thu được, chúng tôi chọn được chủng SLNN có thứ tự 6, 14, 20 có hoạt tính kháng sinh cao. Những dạng chủng này được giữ lại để tiến hành nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1
Tiến hành đột biến dạng chủng SLNN 20 bằng ánh sáng UV, bước sóng λ= 254nm. Chúng tôi thu được 33 biến chủng, tỷ lệ sống sót sau đột biến là 0,43%. Một số kết quả chính đánh giá sự biến đổi hoạt tính kháng sinh sau đột biến được trình bày ở bảng 3.2:
Bảng 3.2 Kết quả đột biến lần 1
chủng (mm) s % biến đổi hoạt tính (mm) s % biến đổi hoạt tính 1 27,84 0,56 107,73 24,69 0,50 98,64 2 28,63 0,58 110,79 26,93 0,48 107,59 3 27,37 0,68 105,92 25,04 0,30 100,03 4 24,93 0,29 96,48 23,22 1,06 92,76 5 26,19 0,39 101,35 25,21 0,33 100,72 6 28,43 0,36 110,02 27,54 0,05 110,02 7 22,59 1,31 87,42 25,63 0,33 102,40 8 24,78 0,54 95,90 24,21 0,64 96,72 9 (chứng) 25,84 0,49 100.00 25,03 0,19 100,00 10 23,41 0,22 90,59 24,12 0,43 96,36 11 28,08 0,62 108,67 26,87 0,39 107,35 12 24,37 0,27 94,31 25,70 0,50 102,68 13 26,99 0,61 104,45 25,67 0,55 102,56
Sau khi đột biến kết hợp với sàng lọc, thu được các biến chủng 2, 6, 11 có hoạt tính kháng sinh cao nhất. Biến chủng 6 được chọn để tiến hành đột biến UV lần 2.
3.1.3 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2
Tiến hành đột biến bằng tia tử ngoại đối với chủng số 6 thu được sau khi ĐB lần 1. Chúng tôi thu được 33 biến chủng mới, tỷ lệ sống sót sau đột biến lần 2 là: 0,36%. Kết quả chính được trình bày ở bảng:
Bảng 3.3 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh lần 2
chủng (mm) s % biến đổi hoạt tính (mm) s % biến đổi hoạt tính 1 31,28 2,22 98,34 28,08 1,28 88,45 2 31,06 0,67 97,65 28,25 1,39 89,00 3 33,55 0,68 105,49 27,17 2,45 85,59 4 34,12 1,25 107,27 32,22 0,39 101,48 5 32,19 2,47 101,22 26,21 0,85 82,57 6 31,51 1,45 99,06 29,94 2,15 94,31 7 33,63 2,88 105,72 30,27 2,10 95,34 8 30,33 1,69 95,35 29,36 0,81 92,48 9 30,40 1,72 95,58 30,37 1,65 95,67 10 30,21 2,06 94,97 28,07 2,07 88,43 11 0,00 0,00 0,00 29,08 1,77 91,60 12 34,38 0,64 108,09 30,86 0,74 97,21 13 31,33 1,61 98,51 30,87 1,00 97,23 14 32,59 1,40 102,47 33,79 0,81 106,43 15 33,35 2,98 104,84 33,59 1,83 105,80 16 34,29 3,07 107,80 32,73 2,28 103,11 Chứng 31,81 0,91 100,00 31,75 1,45 100,00
Nhận xét: Sau ĐB 2 dạng chủng Streptomyces 21.123 thu được các biến chủng 4, 12, 14 có hoạt tính kháng sinh mạnh nhất được giữ lại cho nghiên cứu tiếp theo. Việc đột biến có thể tiến hành nhiều lần với tác nhân để thu được sản lượng kháng sinh cao, tuy nhiên đến một tới hạn nhất định thì việc đột biến sẽ làm thoái hóa giống và làm giảm khả năng sinh tổng hợp, hoạt tính của kháng sinh.
3.2 Kết quả chọn lọc biến chủng tổng hợp kháng sinh tốt nhất trong môi trường dịch thể trường dịch thể
Dựa trên các nghiên cứu trước, chúng tôi sử dụng môi trường MT1 dịch thể để lựa chọn chủng có khả năng STH kháng sinh mạnh nhất trong môi trường dịch thể. Các biến chủng Streptomyces 21.123 đã được chọn qua cải tạo giống. Dịch lọc sau khi loại bỏ sinh khối được thử bằng phương pháp giếng thạch, kết quả được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4 Kết quả lên men chọn biến chủng lên men chìm tốt nhất
Dạng chủng P.mirabilis B.subtilis (mm) s (mm) s SLNN 06 23,3 0,56 24,60 0,96 SLNN 14 13,86 1,13 14,27 1,02 ĐBI 06 19,72 0,87 19,91 1,35 ĐBI 11 18,22 0,69 18,85 0,74 ĐBII 12 24,78 0,91 25,36 1,07 ĐBII 14 19,21 1,12 19,71 2,10
Như vậy biến chủng ĐBII 12 khi lên men dịch thể cho hoạt tính kháng sinh cao nhất. Do đó, chúng tôi chọn biến chủng này để lên men chìm tổng hợp kháng sinh cho thí nghiệm sau này.
3.3 Chiết xuất và tinh chế kháng sinh từ dịch lọc
3.3.1 Chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ
Mục đích: Lựa chọn lại dung môi chiết trong 2 dung môi chiết kiệt nhất đã được thực nghiệm trước đó.
Dịch lên men sau khi lọc loại bỏ sinh khối thu được dịch lọc. Chiết kháng sinh bằng 2 dung môi hữu cơ là n-butanol và ethylacetat ở pH trung tính theo tỷ lệ Vdm:Vdl= 1:5. Đánh giá HTKS bằng phương pháp giấy lọc. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.5:
Bảng 3.5 Kết quả chọn dung môi
Dung môi
P.mirabilis B.subtilis
Pha dung môi Pha nước Pha dung môi Pha nước
(mm) s (mm) s (mm) s (mm) s
n-butanol 24,94 0,89 0,00 0,00 22,82 0,48 0,00 0,00
Ethylacetat 25,04 1,4 0,00 0,00 22,73 0,37 0,00 0.00
Nhận xét: Khi sử dụng dung môi chiết n-butanol đã chọn trước đó và dung môi Ethylacetat cho kết quả không khác biệt quá nhiều về khả năng chiết kiệt cũng như sự ảnh hưởng của dung môi đến hoạt tính kháng sinh. Mặt khác, n- butanol là dung môi có nhiệt độ sôi cao, độc và đắt tiền hơn. Do vậy chúng tôi tiến hành chiết kháng sinh bằng dung môi Ethylacetat.
3.3.2 Kết quả chạy sắc ký lớp mỏng
Dịch chiết dung môi hữu cơ được dùng để chạy sắc ký. Tiến hành SKLM trên hệ dung môi hữu cơ, từ dịch lọc trên bản mỏng sắc ký Silicagel 60 F254 (Merk), với các hệ dung môi có kết quả như sau (Bảng 3.6).
Bảng 3.6 Kết quả SKLM trên B.subtilis
Dung môi Thành phần Tỷ lệ Rf
2 Ethylacetat : Methanol : n-hexan 25:1 0,42
3 Ethylacetat : Methanol : n-hexan 20:1:1 0,51
4 Ethylacetat : Methanol : n-hexan 30:1:1 0,67
5 Ethylacetat : Methanol : Aceton 26:1:1 0,68
6 Ethylacetat : Dicloromethan : Methanol 25:1:1 0,70
Sắc ký đồ với các hệ dung môi đều có vết bằng mắt thường và khi hiện hình bằng VSV. Chúng tôi nhận thấy hệ 4 là hệ có khả năng tách tốt hơn cả do vết sắc ký hình bầu dục, ít bị kéo vết (Xem hình P7- Phụ lục). Vì vậy chúng tôi sử dụng hệ này để tiến hành sắc ký.
3.3.3 Kết quả chạy sắc ký cột
Sắc ký cột lần thứ nhất với hệ dung môi Ethylacetat: Aceton: Triethylamin (2:2:1).
Bột kháng sinh thô (0,1641g) chạy qua cột sắc ký có chiều dài 50cm, Ø=1cm. Lấy được 25 phân đoạn, mỗi phân đoạn 5ml vào các ống nghiệm sạch. Thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khoanh giấy lọc trên VSV kiểm định.
Bảng 3.7 Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1
Phân đoạn B.subtilis P.mirabilis (mm) S (mm) s 1 0 0 0 0 2 0 0 0 0 3 19,47 0,64 17,53 0,68 4 25,68 0,78 23,71 0,74
5 28,40 0,45 28,09 0,05 6 30,81 1,25 29,71 0,72 7 29,12 0,40 26,46 0,03 8 25,03 0,85 23,93 0,16 9 26,56 0,95 28,19 0,78 10 26,61 0,46 27,16 0,17 11 26,33 1,09 25,64 0,20 12 26,23 0,22 23,87 0,69 13 25,43 0,61 24,49 1,03 14 22,78 0,99 22,81 0,47 15 23,81 0,66 22,31 0,30 16 28,26 0,48 22,01 0,75 17 24,54 1,27 23,12 0,08 18 22,11 0,75 19,15 0,66 19 21,15 0,61 19,91 1,09 20 22,13 1,37 19,56 1,72 21 20,16 0,31 19,35 0,47 22 19,75 0,04 19,52 0,06 23 18,27 0,58 18,91 1,03 24 19,18 0,51 19,56 0,31 25 8,93 1,39 8,82 1,14
Bảng 3.8 Kết quả SKLM các phân đoạn có hoạt tính KS lần 1
Phân đoạn Rf
3-4 0,71
17-18 0,58 – 0,26
19-23 0,25
24 -25 0,15
Nhận xét: Sau khi chạy cột lần thứ nhất, dựa trên kết quả hoạt tính kháng sinh trên các phân đoạn và Rf trên bản mỏng chúng tôi sơ bộ xác định có ít nhất 4 thành phần trong hỗn hợp kháng sinh.
Thành phần chính của kháng sinh nằm trong phân đoạn xen phủ với thành phần phụ 1 (5-17). Gộp các phân đoạn cùng Rf, cô thu được bột KS màu đỏ tươi. Đem đi cân thu được 0,1049g KS, hiệu suất tinh chế lần 1 là 63,92%.
Cân 0,1049 g kháng sinh đã tinh chế tiếp tục chạy cột lần 2 với hệ dung môi Ethylacetat : Methanol : n-hexan (30:1:1) thu được 22 phân đoạn, các phân đoạn được thử hoạt tính bằng phương pháp khoang giấy lọc trên VSV kiểm định B.subtilis (Bảng 3.9).
Bảng 3.9 Kết quả thử hoạt tính KS các phân đoạn chạy cột lần 2
Phân đoạn B.subtilis Phân đoạn B.subtilis (mm) s (mm) s 1 0 0 12 21,15 0,68 2 18,94 0,56 13 22,06 0,43 3 20,58 1,16 14 22,47 0,95
4 23,01 1,30 15 22,77 1,13 5 24,75 2,10 16 26,05 1,04 6 26,87 0,70 17 23,86 1,11 7 26,97 0,97 18 21,95 0,55 8 26,68 1,31 19 21,17 0,43 9 26,02 0,66 20 20,94 0,21 10 24,85 0,16 21 19,41 0,32 11 21,37 1,19 22 18,33 0,47
Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn 2-22 bằng hệ dung môi Ethylacetat : Methanol : n-hexan (30:1:1).
Bảng 3.10 Kết quả SKLM các phân đoạn có hoạt tính KS lần 2
Các phân đoạn Rf
2-5 0,69
6-8 0,69- 0,57
9-22 0,57
Nhận xét: Chúng tôi đã lấy kháng sinh tinh chế qua sắc ký cột lần 1 từ phân đoạn 5-7 khi chạy trên SKLM với hệ dung môi Ethylacetat : Methanol : n-
hexan (30:1:1) thì chỉ xuất hiện 2 vết (nhận biết bằng mắt thường và hiện hình VSV). Tuy nhiên khi chạy trên cột lần lại xuất hiện 3 khoảng màu (Hình P8), có sự thay đổi màu sắc rõ rệt trên cột và các phân đoạn. Vì vậy, chúng tôi dự đoán trong hỗn hợp kháng sinh có 3 thành phần (chất 1 và chất 3 là thành phần phụ). Rf của chất 2 và chất 3 giống nhau khi chạy trên bản mỏng silicagel 60 F254 (Merk) hệ dung môi Ethylacetat : Methanol : n-hexan (30:1:1). Dựa vào sự thay đổi màu sắc và hoạt tính kháng sinh trên VSV kiểm định, chúng tôi thu được 3 thành phần tinh khiết trong hỗn hợp kháng sinh.
Tiến hành cất quay chân không thu KS tinh khiết và kết tinh trong ống nghiệm. Chúng tôi thu được lượng kháng sinh như sau:
Bảng 3.11 Thành phần kháng sinh tinh khiết thu
Chất 1 Chất 2 Chất 3
Khối lượng (g) 0,0313 0,0501 0,0013
Dạng tinh thể Các hạt tinh thể Hình kim mảnh đan chéo nhau
Không có hình dạng, không có mặt tinh thể Tuy nhiên với thời gian hạn chế, chúng tôi tập trung nghiên cứu và phân tích 2 thành phần chất 1 và chất 2 là chất có tỷ lệ thành phần lớn nhất và hoạt tính kháng sinh cao nhất trong hỗn hợp.
Hiệu suất tinh chế kháng sinh lần 2: 47,75%; Hiệu suất cả quá trình: 30,05%.
3.4 Kết quả nhiệt độ nóng chảy và biện giải các phổ sơ bộ các thành phần trong hỗn hợp kháng sinh thu được
Nhiệt độ nóng chảy của KS đo được: Chất 1: 242oC; Chất 2: 205,1oC. Phổ hấp thụ tử ngoại của các chất đo được (Xem hình P9, P10).
Bảng 3.12 Kết quả phổ UV Bước sóng (nm) Độ hấp thụ (ABS) Chất 1 443 0,337 290 0,295 Chất 2 443 0,632 288 0,114 254 0,008 203 0,005
Nhận xét: Dựa vào các đỉnh hấp thụ thu được, chúng tôi dự đoán cấu trúc KS có nhân thơm, nối đôi liên hợp, dị tố.
Phổ hấp thụ hồng ngoại (KBr): Chất 1:
- 3427,72 cm-1 đặc trưng cho liên kết –NH (amid) hoặc liên kết –OH (phenol);
- 2974,10 cm-1, 2939,18 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-H (alkan); - 1752,95 cm-1 đặc trưng cho liên kết các C=O (ester);
- 1581,50 cm-1 đặc trưng cho liên kết N-H (amid, amin bậc 1 và bậc 2); - 1478,02cm-1 đặc trưng cho liên kết N=O;
- 1307,56 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-F hoặc liên kết S=O ( sulfonyl chrorid, sulfat, sulfonamid) hoặc liên kết C-N (amin);
- 1194,84 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-X (Fluorid) hoặc liên kết S=O; hoặc liên kết C-N hoặc liên kết C-O (alcol, ether, ester, anhydrid); - 1098,61 cm-1 đặc trưng cho liên kết S=O hoặc liên kết C-N hoặc liên
- 639,48 cm-1, 518,51 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-Cl.
Chất 2
- 3434,70 cm-1 đặc trưng cho liên kết –NH (amid, amin bậc 1 và bậc 2); - 2967,10 cm-1đặc trưng cho liên kết C-H (alkan);
- 2869,39 cm-1 đặc trưng cho liên kết các C=O (aldehyd); - 1748,51 cm-1 đặc trưng cho liên kết các C=O (ester);
- 1581,58 cm-1 đặc trưng cho liên kết N-H (amid, amin bậc 1 và bậc 2);