Nguyên tắc: Mẫu thử được đặt vào môi trường kiểm định trong hộp Petri đã cấy VSV kiểm định. Kháng sinh từ mẫu thử sẽ khuếch tán vào môi trường thạch và ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng ức chế và vòng vô khuẩn.
Tiến hành: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy VSV kiểm định Bacillus subtilis
(Gr+) và Proteus mirabilis (Gr–) nuôi cấy môi trường canh thang. Sau 18-24h ở tủ ấm 37oC, hỗn dịch vi khuẩn đạt nồng độ khoảng 107 – 108 tế bào/ml. Sau khi tiệt trùng môi trường kiểm định, để hạ nhiệt độ xuống 45 – 50oC bổ sung hỗn dịch vi khuẩn vào theo tỉ lệ 2,5ml vi khuẩn cho 100ml môi trường. Lắc đều môi trường chứa VSV kiếm định và đổ vào đĩa Petri với thể tích 20ml/đĩa.
Đưa mẫu vào môi trường VSV kiểm định, ủ trong tủ ấm ở 37oC trong 18- 24h thì lấy ra đo vòng vô khuẩn.
Có 3 phương pháp thử hoạt tính kháng sinh:
Phương pháp khối thạch: Chủng VSV sinh kháng sinh được nuôi cấy trên môi trường đặc ở 28oC trong 6 ngày đem đi thử hoạt tính kháng sinh. Dùng bộ đục lỗ lấy các khổi thạch (Ø=6,0 mm). Đặt khối thạch lên bề mặt đã cấy VSV kiểm định.
Phương pháp giếng thạch: Đục các giếng thạch trên môi trường đã cấy VSV kiếm định (Ø=6 mm), nhỏ 0,05ml mẫu thử vào mỗi giếng thạch.
Phương pháp này áp dụng để thử hoạt tính kháng sinh trong dung dịch nước.
Phương pháp khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc (Ø=6,0 mm) được tẩm 3 lần dịch chiết dung môi hữu cơ của mẫu thử, sấy khô ở nhiệt độ 50oC, sau đó đặt lên bề mặt kiểm định.Phương pháp này dùng để thử hoạt tính kháng sinh của các dịch chiết kháng sinh dễ bay hơi.
Đánh giá kết quả: Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02mm. Kết quả được xử lý theo công thức thống kê:
Với: Di là đường kính vòng vô khuẩn thứ i,
là đường kính trung bình vòng vô khuẩn,
n là số lần lặp lại thí nghiệm.