Môi trường phân lập xạ khuẩn: MT1 là môi trường cho hoạt tính kháng sinh tốt nhất dựa trên nghiên cứu trước đây. Thành phần gồm (g):
Tinh bột: 2,0 KNO3: 0,01 FeSO4.7H2O: 0,01 K2HPO4: 0,05 pH 6,8 – 7,2 NaCl: 0,05 MgSO4.7H2O: 0,05 H2O: vừa đủ 100ml Thạch: 2%
Môi trường lên men dịch thể: thành phần tương ứng môi trường nuôi cấy xạ khuẩn nhưng không có thạch.
Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định: được trình bày bảng 2.1
Bảng 2.1: Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định
TP( g)
MT NaCl Cao thịt Pepton Thạch
Nước (ml) pH Canh thang 0,5 0,3 0,5 - 100 6,8 – 7,2 Thạch thường 0,5 0,3 0,5 1,6 100 6,8 – 7,2 2.1.3 Hóa chất và sinh phẩm Dung môi sử dụng: bảng 2.2
Bảng 2.2: Các loại dung môi sử dụng
Dung môi Khối lượng riêng Nhiệt độ sôi
Butylacetat 0,880 – 0,885 117 – 118 oC Aceton 0,79 56oC Ethanol 0,789 – 0,791 78,3oC n- Butanol 0,81 116 – 118oC Methanol 0,791 – 0,793 64,5oC Triethylamin 0,726 – 0,728 90oC n- Hexan 0,6548 69oC
Ngoài các hóa chất của phòng thí nghiệm thông thường thì phòng thí nghiệm Vi sinh vật còn sử dụng các hóa chất chuyên dụng như sau:
Pepton, cao thịt, thạch agar, tinh bột.
Các muối NaCl, KNO3, FeSO4.7H2O, K2HPO4, MgSO4.7H2O.
Bản mỏng sắc ký silicagen 60 F254, hạt nhồi silicagel 60 F254 (Merck) 0,040- 0,063 mm.
2.1.4 Thiết bị
Bình chạy sắc ký, cột sắc ký (Ø = 1cm, L= 50 cm).
Đĩa Petri, pipet (1ml, 2ml, 5ml, 10ml), ống đong (25ml, 50ml, 250ml), cốc có mỏ (100ml, 250ml), ống nghiệm, bình nón, đèn cồn, đũa thủy tinh…
Tác nhân gây đột biến: Ánh sáng UV (λ= 254nm), nguồn phát sáng Toshiba 60W, điện thế 220V.
Máy móc, thiết bị khác:
Cân phân tích Sartorius BP 121S Cân kỹ thuật Sartorius, TE 210
Tủ ấm Binder, Memmert, Trung Quốc Tủ cấy Aura VF48
Tủ sấy Shallab model 1350 fx
Nồi hấp vô trùng Hirayama HVE- 25 Máy cất quay chân không Buchi Waterbath Tủ lạnh Sanyo
Máy UV-VIS Hitachi
Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300Lf. Máy đo nhiệt độ nóng chảy E2-Melt.
2.2 Nội dung nghiên cứu
Khóa luận được thực hiện với những nội dung sau:
Tiếp tục cải tạo giống theo phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên và đột biến nhân tạo sử dụng tác nhân vật lý.
Lên men sinh tổng hợp kháng sinh.
Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế kháng sinh do Sreptomyces 21.123 tổng hợp. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Xác định phổ UV, phổ IR, phổ khối và nhiệt độ nóng chảy của kháng sinh thu được.
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp nuôi cấy và giữ giống trong ống nghiệm
Chủng Streptomyces 21.123 đã chọn được nuôi cấy trên môi trường thạch nghiêng MT1. Môi trường phân lập được pha, chỉnh pH, đun sôi và phân đều vào ống nghiệm, tiệt trùng ở 118- 120oC/30 phút rồi đặt nghiêng ống nghiệm. Sau khi môi trường đã nguội, dùng que cấy vô trùng cấy zic-zắc các bào tử giống đã chọn rồi ủ trong tủ ấm 28oC trong vòng 7 – 10 ngày. Giống sau khi
phát triển được cất giữ trong tủ lạnh 2oC, định kỳ 3 – 6 tháng cấy truyền giống.
2.3.2 Phương pháp cải tạo giống
2.3.2.1 Phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên
Tạo hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy các bào tử từ ống nghiệm giống pha vào 10ml nước vô trùng lắc đều thu được hỗn dịch bào tử nồng độ 10-1 (định ước). Pha loãng từng mức 10 lần thành hỗn bào tử có nồng độ từ 10-2 – 10-6.
Cấy bào tử: Dùng pipet 1ml vô trùng hút chính xác 0,1ml hỗn dịch bào tử ở các nồng độ pha loãng 10-4, 10-5, 10-6 nhỏ đều lên các Petri đã đổ sẵn môi trường MT1, dùng que trang vô trùng dàn đều hỗn dịch bào tử lên bề mặt thạch. Để trong tủ ấm ở 28oC trong 6 ngày để khuẩn lạc phát triển.
Chọn lọc ngẫu nhiên: Chọn ngẫu nhiên từng khuẩn lạc phát triển đa dạng, mọc riêng rẽ nhau, cấy zic-zắc lên đĩa Petri đã đổ sẵn môi trường phân lập vô trùng. Đặt trong tủ ấm ở 28oC trong 6 ngày, sau đó đem thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch. Chọn những chủng có hoạt tính kháng sinh mạnh nhất.
2.3.2.2 Phương pháp đột biến bằng ánh sáng UV
Tạo hỗn dịch bào tử: Pha loãng hỗn dịch bào tử thành 10ml ở nồng độ 10-1 (định ước). Lấy 1ml pha loãng tiếp đến nồng độ 10-6, 9ml còn lại cho vào đĩa Petri vô trùng.
Đột biến bằng ánh sáng UV: Hỗn dịch trong đĩa Petri được chiếu ánh sáng UV (λ=254nm) với khoảng cách 60cm trong 5 phút. Sau đó để vào chỗ tối 2h rồi tiếp tục pha loãng đến nồng độ 10-5.
Cấy bào tử: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml cấy mẫu chứng ở nồng độ 10-6, cấy mẫu đột biến ở nồng độ 10-4, 10-5. Mỗi nồng độ pha loãng làm 3 đĩa. Sau đó cho vào tủ ấm 28oC trong 6 ngày để khuẩn lạc phát triển.
Xác định tỉ lệ % sống sót: Đếm số khuẩn lạc trong mỗi đĩa, xác định tỷ lệ sống sót theo công thức:
Trong đó: Nm là số khuẩn lạc sau đột biến, No là số khuẩn lạc trong mẫu chứng, 10-k là nồng độ hỗn dịch bào tử.
Chọn lọc các khuẩn lạc đột biến tương tự phép sàng lọc ngẫu nhiên. Làm song song với mẫu chứng, sau 6 ngày để ở tủ ấm 28oC, đem thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch.
Xác định % biến đổi hoạt tính theo công thức:
: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i đột biến, : Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của mẫu chứng.
Chọn 3 – 5 biến chủng nào có % biến đổi hoạt tính (+) cao nhất để tiến hành nghiên cứu tiếp theo.
2.3.3 Phương pháp lên men trên máy lắc.
Tạo giống cấp 1: Chủng nghiên cứu Streptomyces 21.123 sau khi nuôi cấy 6 ngày trong ống thạch nghiêng được cấy sang bình nón 250ml chứa 50ml MT1 dịch thể đã vô trùng bằng cách pha xạ khuẩn với 10ml nước cất vô trùng đổ vào bình nón. Sau đó đem lắc ở 28oC, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 48h.
Lên men: Sau 48h, chủng giống cấp 1 được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa 100ml môi trường MT1 dịch thể với tỷ lệ Vgiống/Vmt =1/10. Các bình lên men được lắc trên máy lắc ở nhiệt độ 28oC, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 120h. Dịch lên men đã tách tế bào được thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp giếng thạch.
2.3.4 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán
Nguyên tắc: Mẫu thử được đặt vào môi trường kiểm định trong hộp Petri đã cấy VSV kiểm định. Kháng sinh từ mẫu thử sẽ khuếch tán vào môi trường thạch và ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng ức chế và vòng vô khuẩn.
Tiến hành: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy VSV kiểm định Bacillus subtilis
(Gr+) và Proteus mirabilis (Gr–) nuôi cấy môi trường canh thang. Sau 18-24h ở tủ ấm 37oC, hỗn dịch vi khuẩn đạt nồng độ khoảng 107 – 108 tế bào/ml. Sau khi tiệt trùng môi trường kiểm định, để hạ nhiệt độ xuống 45 – 50oC bổ sung hỗn dịch vi khuẩn vào theo tỉ lệ 2,5ml vi khuẩn cho 100ml môi trường. Lắc đều môi trường chứa VSV kiếm định và đổ vào đĩa Petri với thể tích 20ml/đĩa.
Đưa mẫu vào môi trường VSV kiểm định, ủ trong tủ ấm ở 37oC trong 18- 24h thì lấy ra đo vòng vô khuẩn.
Có 3 phương pháp thử hoạt tính kháng sinh:
Phương pháp khối thạch: Chủng VSV sinh kháng sinh được nuôi cấy trên môi trường đặc ở 28oC trong 6 ngày đem đi thử hoạt tính kháng sinh. Dùng bộ đục lỗ lấy các khổi thạch (Ø=6,0 mm). Đặt khối thạch lên bề mặt đã cấy VSV kiểm định. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phương pháp giếng thạch: Đục các giếng thạch trên môi trường đã cấy VSV kiếm định (Ø=6 mm), nhỏ 0,05ml mẫu thử vào mỗi giếng thạch.
Phương pháp này áp dụng để thử hoạt tính kháng sinh trong dung dịch nước.
Phương pháp khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc (Ø=6,0 mm) được tẩm 3 lần dịch chiết dung môi hữu cơ của mẫu thử, sấy khô ở nhiệt độ 50oC, sau đó đặt lên bề mặt kiểm định.Phương pháp này dùng để thử hoạt tính kháng sinh của các dịch chiết kháng sinh dễ bay hơi.
Đánh giá kết quả: Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02mm. Kết quả được xử lý theo công thức thống kê:
Với: Di là đường kính vòng vô khuẩn thứ i,
là đường kính trung bình vòng vô khuẩn,
n là số lần lặp lại thí nghiệm.
2.3.5 Phương pháp chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ
Dịch lên men sau khi loại bỏ sinh khối, dịch lọc được chỉnh về pH trung tính.
Chiết 1 lần: Đưa dịch lọc và dung môi vào bình gạn theo tỷ lệ Vdm: Vdl= 1:5, lắc kỹ trong khoảng 1 – 2 phút cho 2 pha tiếp xúc tốt. Sau 1 – 1,5h để phân lớp, tách tiêng dung môi và dịch lọc.
Chiết nhiều lần: Dịch lọc và dung môi hữu cơ được cho vào bình gạn theo tỷ lệ Vdm: Vdl= 1: 15, lắc đều trong 1 – 2 phút, để 1 – 1,5h cho phân pha và
tách riêng pha dung môi và dịch lọc. Chiết lặp lại 2, 3 lần với tỷ lệ (v/v) như trên.
Hoạt tính kháng sinh của dung môi và dịch lọc sau mỗi lần chiết được kiểm tra bằng phương pháp khoanh giấy lọc và giếng thạch với VSV kiểm định. (B. subtilis và P.mirabilis).
2.3.6 Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay chân không
Dịch chiết dung môi hữu cơ được đem cất chân không bằng máy cất quay Buchi Waterbath B480 ở 80oC thu được cắn kháng sinh thô. Cạo cắn bằng patuyn, hòa tan cắn bằng methanol sau đó cho vào đĩa Petri và bốc hơi ở 60oC bằng đun cách thủy rồi đem đi cân.
2.3.7 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký
Tách các thành phần kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng
Bản mỏng Silicagel F254 có kích thước thích hợp được hoạt hóa ở 110oC trong 30 phút. Dung môi được pha theo đúng tỷ lệ trong bình chạy sắc ký và để cho bão hòa trong 30 phút. Chấm dịch chiết lên bản mỏng bằng mao quản, sấy khô ở 40-50oC, cho bản mỏng đã chấm dịch chiết vào bình chạy. Khi dung môi chạy được khoảng ¾ chiều dài bản mỏng thì lấy ra, đánh dấu vị trí dung môi và để khô tự nhiên. Phát hiện sự có mặt kháng sinh bằng cách:
Soi đèn tử ngoại: Bản mỏng sắc ký được trộn với một chất huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại, nếu có vết xuất hiện vết thử sẽ có màu huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại.
Phương pháp hiện hình VSV: Đặt bản mỏng đã chạy sắc ký và sấy khô vào đĩa Petri vô trùng. Đổ môi trường đã cấy VSV kiểm định vào, ủ ở 37oC trong 18- 24h. Nếu có kháng sinh thì vòng vô khuẩn sẽ xuất hiện.
Phương pháp hiện màu hóa học: Bản mỏng sắc ký được phun thuốc thử hiện màu, sấy ở 60oC trong 10 phút, nếu có vết sẽ hiện màu.
Quan sát bằng mắt thường.
Đọc kết quả SKLM: tính Rf theo công thức:
Dv: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm vết,
Ddm: Khoảng cách vạch xuất phát đến vạch dung môi đánh dấu.
Tinh chế kháng sinh thô bằng phương pháp sắc ký cột
Chuẩn bị cột sắc ký: Cột sắc ký Ø= 1cm, dài 50cm. Hạt nhồi cột là Silicagel 60 F254 Merk cỡ hạt 0,04 – 0,063mm. Cân khoảng 6g hạt nhồi cột, hoạt hóa ở 110oC trong 30 phút, đem hòa thành hỗn dịch với hệ dung môi chạy cột và đưa lên cột. Chiều cao của lớp chất nhồi cột khoảng 15cm.
Đưa mẫu chạy sắc ký lên cột: Bột kháng sinh thô được hòa tan trong methanol rồi trộn với 1g Silicagel đã hoạt hóa, sấy khô ở 50 – 60oC. Cho lượng silicagel này lên cột, để ổn định trong 30 phút.
Chạy sắc ký: Pha hệ dung môi sau đó để bão hòa trong khoảng 30 phút. Cho dung môi chảy qua cột với tốc độ 0,5ml/ phút. Chuẩn bị các ống nghiệm khô, sạch, lấy khoảng 20-40 phân đoạn, mỗi phân đoạn 5ml.
Xác định các phân đoạn chứa kháng sinh: Hoạt tính kháng sinh được đánh giá bằng phương pháp khoanh giấy lọc trên VSV kiểm định. Các phân đoạn có hoạt tính KS tiến hành SKLM với hệ dung môi tách tốt nhất đã nghiên cứu trước. Phân đoạn chính là những phân đoạn có hoạt tính kháng sinh mạnh nhất và có cùng Rf. Các phân đoạn có cùng Rf được (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
gộp chung lại với nhau, rồi đem cô, kết tinh, sấy, cân và kiểm tra độ tinh khiết về mặt sắc ký.
2.3.8 Nghiên cứu cấu trúc phân tử kháng sinh bằng phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ tử ngoại (UV) và đo nhiệt độ nóng chảy.
Bột kháng sinh tinh khiết về mặt sắc ký được cân chính xác, đem đi đo phổ UV, phổ hồng ngoại, phổ khối và nhiệt độ nóng chảy. Dựa trên kết quả thu được ta dự đoán các nhóm chức và cấu trúc phân tử kháng sinh thu được.
Chương 3. KẾT QUẢ 3.1 Nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh
3.1.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên chủng Streptomyces 21.123
Từ chủng gốc Streptomyces 21.123, chúng tôi đã sàng lọc ngẫu nhiên trên môi trường phân lập MT1, thu được 35 dạng chủng và đem thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch với VSV kiểm định (B.subtilis và
P.mirabilis). Một số kết quả chính được trình bày ở bảng 3.1 dưới đây:
Dạng chủng B.subtilis P.mirabilis Dạng chủng B.subtilis P.mirabilis (mm) s (mm) s (mm) s (mm) s 1 26,44 1,17 24,21 1,21 12 25,56 0,80 22,96 0,27 2 25,79 1,51 23,91 0,72 13 25,01 0,86 23,16 0,64 3 26,49 1,43 24,09 1,57 14 28,05 0,52 26,01 0,47 4 26,31 0,60 23,98 0,16 15 11,31 0,81 10,13 0,59 5 27,01 0,38 24,05 1,55 16 26,02 1,27 23,28 0,39 6 27,91 0,36 25,28 0,79 17 27,75 1,90 24,98 0,55 7 26,88 0,26 23,90 1,23 18 23,79 0,99 21,11 0,34 8 25,65 0,06 21,23 0,78 19 27,25 0,49 25,78 0,69 9 26,73 0,53 22,78 1,12 20 27,92 0,80 26,31 1,03 10 26,25 0,20 23,24 0,78 21 27,19 0,52 23,13 0,12 11 26,31 0,34 24,16 0,91 22 26,81 0,33 25,29 1,05
Dựa vào kết quả thu được, chúng tôi chọn được chủng SLNN có thứ tự 6, 14, 20 có hoạt tính kháng sinh cao. Những dạng chủng này được giữ lại để tiến hành nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1
Tiến hành đột biến dạng chủng SLNN 20 bằng ánh sáng UV, bước sóng λ= 254nm. Chúng tôi thu được 33 biến chủng, tỷ lệ sống sót sau đột biến là 0,43%. Một số kết quả chính đánh giá sự biến đổi hoạt tính kháng sinh sau đột biến được trình bày ở bảng 3.2:
Bảng 3.2 Kết quả đột biến lần 1
chủng (mm) s % biến đổi hoạt tính (mm) s % biến đổi hoạt tính 1 27,84 0,56 107,73 24,69 0,50 98,64 2 28,63 0,58 110,79 26,93 0,48 107,59 3 27,37 0,68 105,92 25,04 0,30 100,03 4 24,93 0,29 96,48 23,22 1,06 92,76 5 26,19 0,39 101,35 25,21 0,33 100,72 6 28,43 0,36 110,02 27,54 0,05 110,02 7 22,59 1,31 87,42 25,63 0,33 102,40 8 24,78 0,54 95,90 24,21 0,64 96,72 9 (chứng) 25,84 0,49 100.00 25,03 0,19 100,00 10 23,41 0,22 90,59 24,12 0,43 96,36 11 28,08 0,62 108,67 26,87 0,39 107,35 12 24,37 0,27 94,31 25,70 0,50 102,68 13 26,99 0,61 104,45 25,67 0,55 102,56
Sau khi đột biến kết hợp với sàng lọc, thu được các biến chủng 2, 6, 11 có hoạt tính kháng sinh cao nhất. Biến chủng 6 được chọn để tiến hành đột biến UV lần 2.
3.1.3 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2
Tiến hành đột biến bằng tia tử ngoại đối với chủng số 6 thu được sau khi ĐB lần 1. Chúng tôi thu được 33 biến chủng mới, tỷ lệ sống sót sau đột biến lần 2 là: 0,36%. Kết quả chính được trình bày ở bảng:
Bảng 3.3 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh lần 2
chủng (mm) s % biến đổi hoạt tính (mm) s % biến đổi hoạt tính 1 31,28 2,22 98,34 28,08 1,28 88,45 2 31,06 0,67 97,65 28,25 1,39 89,00 3 33,55 0,68 105,49 27,17 2,45 85,59 4 34,12 1,25 107,27 32,22 0,39 101,48 5 32,19 2,47 101,22 26,21 0,85 82,57 6 31,51 1,45 99,06 29,94 2,15 94,31 7 33,63 2,88 105,72 30,27 2,10 95,34 8 30,33 1,69 95,35 29,36 0,81 92,48