2.3.1. C c p ươn p p b o c ế
2.3.1.1. Ph h h ể h polyme azithromycin.
Tiểu phân nano polyme đƣợc bào chế bằng phƣơng pháp nhũ hoá khuếch tán dung môi . Sơ đồ quy trình bào chế đƣợc trình bày ở hình 2.1.
a. Mô tả quy trình :
- Chuẩn bị pha dầu: hoà tan dƣợc chất và polyme Eudragit EPO vào ethyl acetat. - Chuẩn bị pha nƣớc và pha pha loãng: hoà tan polyvinyl alcol (PVA) vào nƣớc
tới nồng độ tƣơng ứng.
- Bão hoà pha nƣớc: thêm 5ml ethyl acetat với 50 ml pha nƣớc, khuấy từ trong 10 phút.
- Giai đoạn nhũ hoá: pha dầu đƣợc nhỏ từ xy lanh thuỷ tinh (kim xy lanh 18G) vào pha nƣớc (dung dịch PVA 0,5%) đã đƣợc bão hoà dung môi hữu cơ. Thiết bị gây phân tán có thể là máy đồng nhất tốc độ cao hoặc máy siêu âm cầm tay kết hợp khuấy từ.
- Khuếch tán dung môi: Phối hợp nhanh nhũ tƣơng thu đƣợc với pha pha loãng (dung dịch PVA 0,1%) đƣợc khuấy trộn bằng khuấy từ.
- Bốc hơi dung môi: tiếp tục khuấy từ nhẹ nhàng để bốc hơi dung môi hữu cơ trong 20 giờ.
- Tinh chế và thu hồi sản phẩm: hỗn dịch nano thu đƣợc đƣợc ly tâm với điều kiện 12000 vòng/phút trong 30 phút. Phần cắn thu đƣợc đƣợc rửa 2 lần với nƣớc cất, sau đó đƣợc phân tán vào khoảng 15 ml nƣớc cất.
b. Các thành phần công thức:
Bảng 2.2. C hứ ể h ể h e.
Thành phần Số lƣợng
Eudragit EPO 1,5 g
Ethyl acetat 10 ml
Dung dịch PVA 0,5% (bão hoà với 5 ml ethyl acetat) 50 ml
Dung dịch PVA 0,1% 400 ml
Mẫu chứa dƣợc chất là mẫu có các thành phần tƣơng tự công thức mẫu trắng chứa tổng khối lƣợng chất rắn là 1,5 g và tỷ lệ dƣợc chất : polyme thay đổi.
2.3.1.2. Ph h h h ể h
Phần cắn sau quá trình ly tâm đƣợc gộp lại và phân tán vào 15 ml nƣớc cất để thu đƣợc hỗn dịch đặc. Hỗn dịch nói trên đƣợc phối hợp với 5 ml dung dịch mannitol 20% sao cho tỷ lệ khối lƣợng mannitol : khối lƣợng nano thu đƣợc sau ly tâm là khoảng 5:1, sau đó đƣợc tiến hành phun sấy trên máy phun sấy Buchi mini spray dryer B-191 với các thông số đƣợc ghi trong bảng 2.3. Bột phun sấy đƣợc thu hồi trên cả cyclon và bộ phận thu hồi sản phẩm, bảo quản trong bình hút ẩm.
Bản 2.3. C h ủ h h .
Tốc độ phun dịch 2 ml/phút
Nhiệt độ khí vào 90oC
Nhiệt độ khí ra 36oC
PHA NƢỚC
(Dung dịch chất ổn định đƣợc bão hoà ethyl
acetat) PHA DẦU (Dƣợc chất, polyme ethyl acetat) Tác động lực cơ học NHŨ TƢƠNG HỆ DỊ THỂ
(Tiểu phân nano, ethyl acetat tồn dƣ, dƣợc chất tự
do, chất ổn định) PHA PHA LOÃNG
(Dung dịch PVA nồng độ thấp) Phối hợp nhanh Ly tâm – rửa Khuấy từ liên tục trong 20 giờ HỆ DỊ THỂ
(Tiểu phân nano, dƣợc chất tự do, chất ổn định)
TIỂU PHÂN NANO
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano polyme azithromycin
2.3.2. C c p ươn p p đ n .
2.3.2.1. Ph h h ợng azithromycin
Azithromycin trong các mẫu thử đƣợc định lƣợng bằng phƣơng pháp đo độ hấp thụ quang của sản phẩm giáng hoá bằng tác nhân acid sulfuric 70% (kl/kl) đƣợc tham khảo từ khoá luận về nghiên cứu sinh khả dụng của viên nang azithromycin [1].
- Phƣơng pháp đo độ hấp thụ quang của sản phẩm giáng hoá đƣợc tiến hành nhƣ sau:
- Mẫu chuẩn: cân chính xác khoảng 0,0125 g nguyên liệu Azi, cho vào bình định mức 100 ml. Thêm khoảng 2,5 ml ethanol, lắc cho tan hết. Thêm khoảng 70 ml dung dịch đệm phosphat pH 6,0 (7,18 g dinatri hydrophosphat đƣợc hoà tan vào 150 ml nƣớc, điều chỉnh pH bằng dung dịch HCl đến pH 6,0), lắc đều, đậy kín và siêu âm trong 15 phút. Từ dung dịch trên pha loãng thành các dung dịch chuẩn có các nồng độ nằm trong khoảng từ 25 đến 75 μg/ml.
- Thuốc thử dẫn chất hoá: acid sulfuric 70% (kl/kl).
- Xác định nồng độ Azi trong mẫu thử và mẫu chuẩn: 5 ml dung dịch azithromycin đã đƣợc pha loãng đến nồng độ thích hợp, thêm chính xác 5 ml dung dịch acid sulfuric 70%. Để phản ứng 20 phút ở nhiệt độ phòng.
- Mẫu trắng là 5ml dung dịch đệm phosphat pH 6,0 với 5 ml dung dịch acid sulfuric 70% để yên trong 20 phút ở nhiệt độ phòng.
- Đo quang tại bƣớc sóng 482 nm. - Cách tính kết quả:
Ct =
Trong đó:
Ct, Cc lần lƣợt là nồng độ mẫu thử và mẫu chuẩn (μg/ml) D là hệ số pha loãng của mẫu thử
2.3.2.2. C h h h ể h Azithromycin.
a. Đánh giá kích thƣớc và phân bố kích thƣớc tiểu phân bằng phƣơng pháp phổ tƣơng quan photon.
Nguyên tắc xác định KTTP: KTTP đƣợc xác định bằng phƣơng pháp phổ tƣơng quan photon. Chiếu 1 chùm tia laser vào hệ, ánh sáng tán xạ từ tiểu phân đƣợc hứng lên 1 màn chắn. Phân tích sự dao động của cƣờng độ ánh sáng tán xạ ta có thể đánh giá đƣợc chuyển động Brown và đánh giá kích thƣớc hạt nhờ phƣơng trình Stockes- Einstein.
Phƣơng pháp: tiểu phân nano sau ly tâm và rửa 2 lần bằng nƣớc cất đƣợc phân tán vào một lƣợng nƣớc vừa đủ sao cho count rate nằm trong khoảng 200-400 kcps.
Với giọt pha dầu: nhũ tƣơng đƣợc pha loãng vào nƣớc đƣợc bão hoà ethyl acetat bằng bình gạn và đo ngay sau khi pha.
Sử dụng cuvet thuỷ tinh, chỉ số khúc xạ RI là 1,34 và độ hấp thụ là 0,001. b. Đánh giá thế zeta của tiểu phân bằng phƣơng pháp phổ tƣơng quan photon
Nguyên tắc xác định thế zeta: Khi đặt 1 điện trƣờng lên hệ, tiểu phân sẽ di chuyển về phía điện cực trái dấu với vận tốc tỷ lệ với thế zeta. Tốc độ này đƣợc xác định dựa vào việc phân tích chuyển động của tiểu phân thông qua ánh sáng tán xạ. Thế zeta đƣợc xác định dựa vào độ nhớt môi trƣờng và định luật Smoluchowski- Huckel.
Phƣơng pháp: tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp xác định kích thƣớc tiểu phân với cuvet nhựa có 2 lá điện cực bằng đồng.
c. Đánh giá hình thái và kích thƣớc hệ nano bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM – Transmission Electron Microscope ).
Nguyên tắc: Một chùm electron hội tụ có năng lƣợng cao đƣợc truyền đến mẫu có bề dày siêu mỏng. Tƣơng tác giữa các điện tử và mẫu có 2 kiểu là đàn hồi và không đàn hồi. Trong tƣơng tác đàn hồi, điện tử không bị mất năng lƣợng. Trong tƣơng tác không đàn hồi, điện tử mất một phần năng lƣợng và tạo ra nhiều tín hiệu nhƣ: điện tử thứ cấp, điện tử Auger, tia X, tia khả kiến. Các electron truyền đƣợc
qua mẫu cũng xuất hiện cùng lúc này. Do sự giảm năng lƣợng của electron phụ thuộc chủ yếu vào mật độ và độ dày của mẫu nên các điện tử truyền qua này tạo nên ảnh hai chiều của mẫu phân tích.
Xử lí mẫu: Pha loãng hỗn dịch đặc chứa tiểu phân nano polyme 100 lần, nhỏ trên lƣới đồng. Để khô bề mặt lƣới đồng ở nhiệt độ phòng. Sau đó quan sát mẫu bằng kính hiển vi điện tử truyền qua.
d. Phƣơng pháp xác định hiệu suất mang thuốc trong tiểu phân nano Hàm lƣợng Azi trong các mẫu nghiên cứu đƣợc tiến hành nhƣ sau:
- Cắn sau quá trình ly tâm đƣợc gộp lại và phân tán trong 1 lƣợng nhỏ nƣớc cất để đƣợc hỗn dịch đặc. Đổ hỗn dịch nói trên lên mặt kính đồng hồ, sấy khô bằng tủ sấy tĩnh tại 40o
C trong 20 giờ. Cạo và cân chính xác khoảng 0,03 g chất rắn, thêm vào bình định mức 25 ml. Thêm 15 ml dung dịch acid pH 1,2 (8,5ml acid hydrocloric đặc, thêm nƣớc vừa đủ đến 1000 ml, điều chỉnh bằng dung dịch natri hydroxyd 10%). Đậy kín và siêu âm trong 15 phút. Bổ sung dung dịch acid pH 1,2 vừa đủ đến vạch, pha loãng dung dịch thử đến nồng độ thích hợp. Nồng độ Azi trong dung dịch thử bằng phƣơng pháp đo quang tại mục 2.3.3.1.
- Công thức tính tỷ lệ nạp thuốc:
Hiệu suất mang thuốc = = x104 Trong đó:
At và Ac là độ hấp thụ của mẫu thử và mẫu chuẩn Cc là nồng độ Azi trong mẫu chuẩn (μg/ml) m là khối lƣợng cân (μg)
d là tỷ lệ dƣợc chất trên tổng khối lƣợng chất rắn theo lý thuyết (%) D là hệ số pha loãng
e. Phƣơng pháp đánh giá tốc độ hoà tan của tiểu phân nano polyme azithromcyin Qua tham khảo nghiên cứu về nano azithromycin đƣờng uống của Zhang và cộng sự [20], chúng tôi tiến hành đánh giá tốc độ hoà tan của Azi từ hệ tiểu phân
nano so với nguyên liệu thô bằng cách sử dụng túi thẩm tích (12000 - 14000 Dalton). Các điều kiện và các bƣớc tiến hành cụ thể nhƣ sau:
- Thiết bị: máy cánh khuấy, tốc độ 100 vòng trên phút
- Môi trƣờng hoà tan: 250 ml môi trƣờng đệm pH 4,5 (hoà tan 1,8g Natri acetat trong 900 ml, điều chỉnh pH bằng dung dịch acid acetic 2N, thêm nƣớc đến 1000 ml).
- Nhiệt độ môi trƣờng hoà tan 37oC ± 0,5oC.
- Lấy mẫu vào các thời điểm 15 phút, 30 phút, 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, hút chính xác 5 ml môi trƣờng thử bằng pipet, không bổ sung môi trƣờng.
- Mẫu thử chứa tiểu phân nano: Cắn sau mỗi quá trình ly tâm đƣợc phân tán bằng máy lắc xoáy vào trong một lƣợng nhỏ nƣớc cất, sau đó gộp lại để thu đƣợc khoảng 13 ml hỗn dịch đặc chứa khoảng 50 mg azithromycin. Lắc đều hỗn dịch nói trên bằng máy lắc xoáy trong 3 phút, hút hính xác 5 ml hỗn dịch đặc nói trên cho vào túi thẩm tích.
- Do hiệu suất ly tâm khác nhau giữa các lần, nồng độ Azi trong hỗn dịch đặc đƣợc xác định lại bằng cách: lắc đều hỗn dịch đặc trong 3 phút bằng máy lắc xoáy, sau đó hút chính xác 1 ml hỗn dịch đặc vào bình định mức 50 ml. Thêm 30 ml dung dịch acid pH 1,2 (pha nhƣ mục 2.3.2.2.d), lắc đều, đậy kín và siêu âm trong 15 phút. Bổ sung dung dịch acid pH 1,2 vừa đủ đến vạch, pha loãng dung dịch thử đến nồng độ thích hợp. Nồng độ Azi trong hỗn dịch đặc đƣợc xác định theo các bƣớc ghi tại mục 2.3.2.1.
- Mẫu thử chứa nguyên liệu: cân chính xác khối lƣợng bột nguyên liệu Azi vào túi thẩm tích, thêm chính xác 5 ml nƣớc, sao cho nồng độ Azi trong mẫu nguyên liệu xấp xỉ nồng độ Azi trong hỗn dịch đặc đã định lƣợng ở trên (chênh lệch không quá 0,1 mg/ml ). Lắc đều bằng tay trong 2 phút.
- Mẫu chuẩn: chuẩn bị nhƣ mục 2.3.2.1.
- Dẫn chất hoá 5ml mẫu thử và mẫu chuẩn đƣợc chuẩn bị ở trên với 5ml acid sulfuric 70% (kl/kl), để phản ứng trong 20 phút. Tiến hành đo quang các mẫu trên tại bƣớc sóng 482 nm.
- Cách tính kết quả:
Nồng độ Azi ở thời điểm t đƣợc tính theo công thức ghi tại mục 2.2.3.1.
- Khối lƣợng Azi đã giải phóng ra môi trƣờng tại thời điểm ti đƣợc tính bằng công thức:
[ ] ∑
Trong đó:
mi là khối lƣợng Azi đã giải phóng ra môi trƣờng hoà tan tại thời điểm ti
Ci là nồng độ Azi trong môi trƣờng thử tại thời điểm ti
Phần trăm giải phóng tích luỹ tại thời điểm ti đƣợc xác định bằng công thức: % Azi tại thời điểm ti =
x 100 Trong đó:
mi là khối lƣợng đã giải phóng tại thời điểm ti
mo là khối lƣợng dƣợc chất ban đầu đƣa vào trong túi thẩm tích f. Phƣơng pháp đánh giá độ ổn định về kích thƣớc của tiểu phân nano
Mẫu nano polyme azithromycin và mẫu trắng đƣợc bảo quản tại 40oC trong 2 tháng. Độ ổn định đƣợc đánh giá bằng cách so sánh kích thƣớc tiểu phân sau bảo quản và kích thƣớc tiểu phân ban đầu của các mẫu.
g. Xác định sơ bộ hiệu suất thu hồi sản phẩm
Phần cắn thu đƣợc sau khi ly tâm đƣợc phân tán vào 1 lƣợng nhỏ nƣớc, gộp lại và đƣợc đông khô. Hiệu suất thu hồi sản phẩm đƣợc xác định sơ bộ bằng tỷ số giữa tổng khối lƣợng bột đông khô và tổng khối lƣợng bột thu đƣợc trên lý thuyết.
h. Phân tích phổ nhiễu xạ tia X
Mẫu nano polyme sau khi đƣợc bào chế đem tiến hành đông khô trên thiết bị đông khô Labocono Freezone Triad 740030. Tiến hành chạy chƣơng trình đông khô với các thông số: giai đoạn đông lạnh làm đông đặc mẫu ở nhiệt độ -650
C trong 3 giờ. Giai đoạn làm khô sơ cấp: tăng dần nhiệt độ của mẫu lên -250C với tốc độ 0,250C/ phút, duy trì 24 giờ ở áp suất 0,45 mBar. Giai đoạn làm khô thứ cấp: tăng
dần nhiệt độ của mẫu lên 100C với tốc độ 0,50C/phút, duy trì 8 giờ ở áp suất o,45 mBar.
Nghiên cứu phổ nhiễu xạ tia X của nguyên liệu Eudragit EPO, azithromycin, mannitol, tiểu phân nano azithromycin đông khô đƣợc thực hiện trên máy nhiễu xạ tia X: SIEMENS D5000 của phòng Nhiễu xạ tia X của Viện khoa học vật liệu thuộc Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ Quốc gia.
2.3.2.3. Ph h h h hứ z h .
a. Kích thƣớc sau khi phân tán trở lại vào nƣớc
Lấy một lƣợng nhỏ bột phun sấy, phân tán vào nƣớc trong 5 phút nhờ máy lắc xoáy để tạo đƣợc hỗn dịch đục nhẹ. Kích thƣớc tiểu phân sau tái tạo đƣợc đánh giá bằng công cụ phổ tƣơng quan photon với cách tiến hành tƣơng tự nhƣ mục 2.3.2.2.b.
b. Hình thái bột phun sấy
Nguyên tắc: sử dụng kính hiển vi điện tử FESEM Hitachi S-4800 có độ phóng đại M=20x-800000x; độ phân giải δ=1,0 nm; điện áp gia tốc U=0,5-30 kV. Chùm điện tử quét trên toàn bộ bề mặt của mẫu đƣợc thu lại bởi các đầu dò để biến đổi thành những tín hiệu phản ánh bề mặt, thành phần của mẫu đƣa ra màn hình quan sát. Do cách tạo ảnh, các ảnh SEM có đặc điểm của ảnh ba chiều [22].
Tiến hành: phân tán mẫu bột phun sấy trên một khung carbon, sau đó phủ một lớp platin rồi đặt vào buồng soi mẫu của thiết bị.
c. Hiệu suất quá trình phun sấy
Hiệu suất quá trình phun sấy đƣợc xác định bằng tỷ số khối lƣợng giữa khối lƣợng bột phun sấy thu đƣợc và tổng khối lƣợng manitol và tiểu phân nano d. Phân tích phổ nhiễu xạ tia X
Phân tích phổ nhiễu xạ tia X của bột phun sấy đƣợc thực hiện trên máy nhiễu xạ tia X: SIEMENS D5000 của phòng Nhiễu xạ tia X của Viện khoa học vật liệu thuộc Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ Quốc gia.
CHƢƠNG 3.THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Khảo sát phƣơng pháp định lƣợng azithromycin
Để xác định hàm lƣợng azithromycin, chúng tôi tiến hành khảo sát phƣơng pháp đo độ hấp thụ quang của sản phẩm giáng hoá azithromycin. Kết quả đƣợc thể hiện trong các bảng và hình dƣới đây:
Bản 3.1. M h hụ ồ azithromycin
Nồng độ (μg/ml) 25,0 37,5 50,0 62,5 75,0 Độ hấp thụ 0,225 0,377 0,478 0,614 0,699
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan giữa độ hấp thụ và nồng độ azithromycin
Kết quả cho thấy: r2 > 0,99, do vậy có sự tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ trong khoảng nồng độ nói trên, thao tác thuận tiện do vậy chúng tôi tiến hành sử dụng phƣơng pháp trên để định lƣợng azithromycin trong các thí nghiệm tiếp theo.
3.2. Xây dựng quy trình bào chế tiểu phân nano polyme bằng phƣơng pháp
nhũ hoá khuếch tán dung môi
Để thấy đƣợc xu hƣớng ảnh hƣởng của các yếu tố lên KTTP và lựa chọn ra các thông số tối ƣu cho quy trình bào chế tiểu phân nano polyme, chúng tôi tiến hành bào chế và khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng lên KTTP mẫu trắng là tiểu phân nano polyme Eudragit EPO.
y = 0.0095x + 0.0046 R² = 0.9921 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0 25 50 75 100 Độ t hấ p t hụ Nồng độ azithromycin (μg/ml)
Bản 3.2. C hứ ể h ể h e
Thành phần Số lƣợng
Eudragit EPO 1,5g
Ethyl acetat 10 ml
Dung dịch PVA 0,5 % (bão hoà bằng 5ml ethyl acetat) 50 ml
Dung dịch PVA 0,1 % 400 ml
3.2.1. K ảo s t ản ưởn của t ết bị gây phân tán
3.2.1.1. Khả ả h h ủ ạ h
Máy đồng nhất tốc độ cao Unidriver X1000 đƣợc khảo sát với 3 tốc độ là 3900, 6800 và 9800 vòng/phút trong 12 phút. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.3: