nhũ hoá khuếch tán dung môi
Để thấy đƣợc xu hƣớng ảnh hƣởng của các yếu tố lên KTTP và lựa chọn ra các thông số tối ƣu cho quy trình bào chế tiểu phân nano polyme, chúng tôi tiến hành bào chế và khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng lên KTTP mẫu trắng là tiểu phân nano polyme Eudragit EPO.
y = 0.0095x + 0.0046 R² = 0.9921 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0 25 50 75 100 Độ t hấ p t hụ Nồng độ azithromycin (μg/ml)
Bản 3.2. C hứ ể h ể h e
Thành phần Số lƣợng
Eudragit EPO 1,5g
Ethyl acetat 10 ml
Dung dịch PVA 0,5 % (bão hoà bằng 5ml ethyl acetat) 50 ml
Dung dịch PVA 0,1 % 400 ml
3.2.1. K ảo s t ản ưởn của t ết bị gây phân tán
3.2.1.1. Khả ả h h ủ ạ h
Máy đồng nhất tốc độ cao Unidriver X1000 đƣợc khảo sát với 3 tốc độ là 3900, 6800 và 9800 vòng/phút trong 12 phút. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.3:
Bảng 3.3. M h ồ h i KTTP và PDI.
Tốc độ đồng nhất (rpm) 3900 6800 9800
Z-average (d.nm) 605,3 379,6 375,2
PDI 0,660 0,237 0,304
Nhận xét: khi sử dụng máy đồng nhất hoá, KTTP có xu hƣớng giảm khi tăng tốc độ đồng nhất. Tuy vậy, mặc dù sử dụng ở tốc độ tƣơng đối cao và tốn nhiều năng lƣợng, KTTP và PDI vẫn còn lớn. Nguyên nhân có thể là do máy đồng nhất tạo ra nhiều bọt, ngăn cản sự tiếp xúc đồng đều giữa 2 pha.
Máy siêu âm cầm tay Labsonic® M – Sartorius đƣợc khảo sát với nhịp phát xung 0,7s và 3 cƣờng độ lần lƣợt là 40, 80, 100% công suất tối đa kết hợp với khuấy trộn pha nƣớc bằng máy khuấy từ trong thời gian 12 phút. Kết quả về KTTP của các mẫu thu đƣợc đƣợc thể hiện ở bảng 3.4:
Bản 3.4. M h K P PDI.
Cƣờng độ siêu âm 40% 80% 100%
Z-average (nm) 206,7 175,0 176,7
Nhận xét: khi sử dụng máy siêu âm kết hợp với khuấy từ, KTTP cũng có xu hƣớng giảm khi giảm cƣờng độ siêu âm. KTTP thu đƣợc tƣơng đối nhỏ (< 200 nm) và PDI gần 0,1 cho thấy KTTP của hệ đồng nhất. Bên cạnh việc làm giảm kích thƣớc giọt pha dầu, hiệu quả làm giảm KTTP có thể là do máy siêu âm làm tăng nhiệt độ, làm đẩy nhanh quá trình khuếch tán dung môi và hình thành tiểu phân.
Do có nhiều ƣu điểm (thuận tiện, tốn ít năng lƣợng, KTTP và PDI nhỏ) nên máy siêu âm cầm tay Labsonic® M – Sartorius với các thông số là nhịp phát xung 0,7 s và 100% cƣờng độ đƣợc lựa chọn để tiến hành các bƣớc khảo sát tiếp theo.
3.2.1.2. Khả ả h h ủ h
Thời gian siêu âm đƣợc khảo sát với 2 mức là 12 phút và 30 phút kể từ lúc bắt đầu phối hợp pha dầu vào pha nƣớc Bên cạnh mẫu trắng, chúng tôi tiến hành khảo sát với cả mẫu chứa 20% dƣợc chất so với tổng lƣợng chất rắn. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng dƣới đây:
Bản 3.5. Ả h h ủ h K P.
Thời gian siêu âm KTTP (nm) PDI
12 phút Mẫu trắng 176,7 0,119
Chứa dƣợc chất 200,6 0,142
30 phút Mẫu trắng 271,5 0,168
Chứa dƣợc chất 1092 1,000
Nhận xét: Tăng thời gian siêu âm lên 30 phút không giúp làm giảm KTTP mà ngƣợc lại làm tăng KTTP. Nguyên nhân của hiện tƣợng này là do máy siêu âm làm tăng nhiệt độ, các giọt pha dầu có thể bị kết tụ lại với nhau. Bên cạnh đó, ethyl acetat bay hơi khiến các tiểu phân rắn hình thành ngay trong giai đoạn nhũ hoá, làm mất vai trò làm giảm KTTP của bƣớc khuếch tán.
Từ bảng 3.5 ta cũng có thể thấy, sau khi siêu âm 30 phút, mẫu chứa dƣợc chất có kích thƣớc tăng gấp nhiều lần so với mẫu trắng. Lý giải cho hiện tƣợng này là do độ tan của dƣợc chất trong pha ngoại lớn hơn polyme, dẫn đến tốc độ tạo mầm
của dƣợc chất thấp, dƣợc chất dễ bị kết tinh lại tạo thành các tinh thể có kích thƣớc rất lớn. Do vậy, thời gian siêu âm đƣợc cố định là 12 phút với các mẫu tiếp theo.
3.2.2. K ảo s t ản ưởn của t n p ần côn t ức
3.2.2.1. Khả ả h h ủ h lên KTTP
Phƣơng pháp NHKTDM đòi hỏi dung môi hữu cơ phải tan một phần trong nƣớc. So với một số dung môi khác, ethyl acetat tan một phần trong nƣớc, hầu nhƣ không có độc tính và có khả năng hoà tan rất tốt cả 2 thành phần là Eudragit EPO và azithromycin, từ đó dễ dàng điều chỉnh tỷ lệ polyme và dƣợc chất. Do vậy ethyl acetat đƣợc lựa chọn làm dung môi pha dầu.
Bảng 3.6. Đ ủ Eudragit EPO và Azi trong ethyl acetat.
Thành phần Độ tan trong ethyl acetat
Eudragit EPO 0,897 – 0,902 g/ml
Azithromycin > 1g/ml
a. Ảnh hƣởng của thể tích ethyl acetat
Thể tích ethyl acetat thay đổi sẽ ảnh hƣởng đến độ nhớt, khả năng bị chia cắt của giọt pha dầu, từ đó ảnh hƣởng lên KTTP. Bên cạnh đó, lƣợng ethyl acetat lớn cũng sẽ làm tăng thời gian cần thiết để bốc hơi dung môi và tăng thể tích pha pha loãng cần thiết để khuếch tán dung môi.
Do vậy, để tìm ra thể tích dung môi cần thiết tối thiểu cho 1,5g chất rắn, chúng tôi tiến hành bào chế mẫu trắng với các thành phần tƣơng tự bảng 3.2 nhƣng thay đổi thể tích ethyl acetat với 4 mức lần lƣợt là 5, 10, 15 và 20 ml. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
- 5ml ethyl acetat có thể hoà tan đƣợc hoàn toàn 1,5g Eudragit EPO, tuy vậy khi đó pha dầu có độ nhớt lớn, gây bám dính dụng cụ, khó thao tác và làm giảm hiệu suất.
- Với 3 thể tích 10, 15 và 20 ml ethyl acetat, KTTP có xu hƣớng tăng nhẹ. KTTP và PDI của các mẫu đƣợc thể hiện ở hình 3.5.
- Do việc tăng lƣợng ethyl acetat không giúp làm giảm kích thƣớc tiểu phân, thể tích ethyl acetat đƣợc lựa chọn là 10 ml cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.2. Đồ thị thể hiện tƣơng quan giữa lƣợng ethyl acetat với KTTP và PDI b. Ảnh hƣởng của thời gian khuếch tán và bốc hơi dung môi hữu tới đặc tính của hệ nano
Trong phƣơng pháp NHKTDM, tiểu phân hình thành vào giai đoạn khuếch tán dung môi (dùng máy khuấy trục hoặc máy khuấy từ ). Sau đó, vào giai đoạn tinh chế, dung môi hữu cơ đƣợc loại đi nhờ bốc hơi nhờ khuấy từ, dƣới áp suất giảm hoặc thẩm tích. Để phù hợp với điều kiện thí nghiệm, chúng tôi sử dụng khuấy từ cho cả 2 bƣớc khuếch tán và bốc hơi dung môi. Để khảo sát ảnh hƣởng của thời gian khuếch tán và bốc hơi dung môi lên các đặc tính của tiểu phân, chúng tôi tiến hành bào chế và theo dõi sự thay đổi của KTTP và thế zeta theo thời gian khuếch tán và bốc hơi dung môi. Kết quả thu đƣợc đƣợc biểu diễn ở hình 3.3 và bảng 3.7.
Hình 3.3. Đồ thị thể hiện sự thay đổi của KTTP và PDI theo thời gian khuếch 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 50 100 150 200 250 10ml 15ml 20ml PDI K T T P ( nm ) Thể tích Ethyl Acetat (ml) Size (nm) PDI 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 100 200 300 400 500 Tiền NT 1h 3h 5h 7h 9h PDI K T T P ( nm ) KTTP PDI NT
Nhìn vào đồ thị hình 3.3 ta thấy đƣợc vai trò làm giảm KTTP của bƣớc khuếch tán dung môi:
- KTTP của giọt pha dầu lớn hơn so với kích thƣớc hạt nano (300 nm so với 180 nm). Hạt nano đƣợc tạo thành sớm và tƣơng đối ổn định về mặt kích thƣớc.
- Pha pha loãng giúp cho dung môi đƣợc khuếch tán nhanh chóng ra môi trƣờng, tránh đƣợc sự kết tụ theo thời gian của các giọt pha dầu nhƣ với phƣơng pháp nhũ hoá bốc hơi dung môi. Bên cạnh đó, sự chênh lệch về sức căng bề mặt giữa 2 dung môi nƣớc và ethyl acetat sẽ tạo thành các chuyển động hỗn loạn trên bề mặt 2 pha cũng giúp chia cắt các giọt pha dầu thành các tiểu phân có kích thƣớc nhỏ hơn [16].
Bảng 3.7. G h ze he h h h h
Thời gian 1 giờ 3 giờ 5 giờ 7 giờ 9 giờ
Thế zeta (mV) + 31 + 37 + 44 + 42
Chú thích (-) h ễ ạ h ợ
Ngƣợc lại với độ ổn định về kích thƣớc, trong các giờ đầu kết quả đo thế zeta rất không ổn định do ethyl acetat tồn dƣ còn nhiều và ảnh hƣởng đến sự xắp xếp không gian xủa các nhóm mang điện [11]. Ethyl acetat rất khó loại bỏ hoàn toàn khỏi hỗn hợp với nƣớc [11] nên để loại trừ tối đa ảnh hƣởng của ethyl acetat lên kết quả phép đo, chúng tôi lựa chọn tổng thời gian khuếch tán và bốc hơi dung môi là 20 giờ.
3.2.2.2 Khả ả h h ủ h
So với nhiều loại chất ổn định khác nhƣ tween hay poloxamer, PVA có nhiều ƣu điểm nhƣ ít tác dụng dƣợc lý, ít độc tính khi dùng với đƣờng uống và phù hợp với nhiều phƣơng pháp để bào chế tiểu phân nano [5, 16]. Do vậy, chúng tôi chỉ sử dụng PVA làm chất ổn định.
a. Ảnh hƣởng của nồng độ PVA lên KTTP
Nồng độ của PVA trong pha nƣớc ảnh hƣởng lên kích thƣớc của giọt pha dầu, khả năng khuếch tán của dung môi trong giai bƣớc khuếch tán, từ đó ảnh hƣởng lên
kích thƣớc của tiểu phân nano. Các mẫu đƣợc bào chế với nồng độ PVA trong pha nƣớc thay đổi từ 0,25 đến 2%. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.4:
Hình 3.4. Đồ thị thể hiện ảnh hƣởng của nồng độ PVA lên KTTP và PDI
Nồng độ PVA trong pha nƣớc càng thấp, kích thƣớc tiểu phân và PDI càng lớn. Tuy vậy, khi nồng độ PVA tăng lên đến 2%, PDI tăng lên đến 0,2 và đồ thị phân bố kích thƣớc xuất hiện thêm pic ở vùng kích thƣớc μm (phụ lục 1.3). Hiện tƣợng này có thể là do nồng độ PVA tăng lên, vừa giúp ổn định giọt pha dầu, kích thƣớc giọt nhỏ hơn [13].
Xét trên tiêu chí về KTTP và để hạn chế lƣợng PVA cần sử dụng, chúng tôi lựa chọn nồng độ PVA 1% với KTTP 150 nm và PDI 0,111 để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
b. Ảnh hƣởng của việc bão hoà pha nƣớc với dung môi hữu cơ
Phƣơng pháp NHKTDM đòi hỏi pha nƣớc phải đƣợc bão hoà với dung môi hữu cơ để đảm bảo độ ổn định của nhũ tƣơng trong giai đoạn nhũ hoá. Chúng tôi tiến hành bão hoà pha nƣớc với ethyl acetat bằng cách phối hợp 5 ml ethyl acetat với pha 50 ml pha nƣớc (xấp xỉ với độ tan của ethyl acetat trong nƣớc ở 20oC). KTTP và PDI của mẫu có bƣớc bão hoà dung môi (150 nm) nhỏ hơn so với mẫu tiến hành ở cùng điều kiện nhƣng không có bƣớc bão hoà (270 nm). Cách làm này cho thấy hiệu quả, đơn giản và thuận tiện hơn phƣơng pháp bão hoà thông thƣờng sử dụng bình gạn (do dung dịch PVA dễ tạo bọt).
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 50 100 150 200 250 0.25% 0.50% 1% 2% PDI K TTP (n m ) Nồng độ PVA (%)
3.3. Nghiên cứu bào chế và đánh giá một số đặc tính của tiểu phân nano polyme azithromycin polyme azithromycin
Sau khi đã khảo sát và lựa chọn đƣợc các thông số tối ƣu để bào chế đƣợc tiểu phân nano polyme với kích thƣớc rất nhỏ và đồng đều (KTTP 150 nm; PDI 0,111) chúng tôi tiến hành bào chế tiểu phân nano polyme chứa azithromycin với các thông số đƣợc khảo sát ở trên và thay đổi 2 yếu tố quan trọng có thể gây ảnh hƣởng đến hiệu suất thu hồi Azi trong phƣơng pháp NHKTDM là tỷ lệ khối lƣợng dƣợc chất : polyme và thể tích pha pha loãng, từ đó đánh giá một số đặc tính của tiểu phân nano polyme chứa azithromycin.
Các khảo sát sơ bộ cho thấy: giảm thể tích pha pha loãng xuống 200 ml sẽ khiến cho quá trình khuếch tán không diễn ra đồng đều, trên thành cốc xuất hiện các cục vón lớn làm giảm hiệu suất. Do vậy, chúng tôi tiến hành bào chế các công thức sử dụng 300 và 400 ml pha pha loãng với tỷ lệ dƣợc chất polyme lần lƣợt là 1:9, 1:3 và 2:3 (tổng khối lƣợng dƣợc chất và polyme đƣợc cố định là 1,5 g).
Các mẫu sau quá trình bào chế đƣợc đánh giá dựa trên các tiêu chí: KTTP, thế zeta, hiệu suất mang thuốc và tổng hàm lƣợng dƣợc chất thu hồi đƣợc sau quá trình tinh chế. Các công thức đƣợc trình bày cụ thể ở bảng 3.8.
Bản 3.8. h h h hứ ể h e azithromycin ỷ ợ h : e hể h h h h h
Tên công thức Tỷ lệ dƣợc chất polyme
(tổng khối lƣợng: 1,5 g) Thể tích pha pha loãng (ml) CT1 1 : 9 300 CT2 1 : 9 400 CT3 1 : 3 300 CT4 1 : 3 400 CT5 2 : 3 300 CT6 2 : 3 400
3.3.1. Ản ưởn của c c yếu tố lên KTTP
Theo nhiều nghiên cứu, sự có mặt của dƣợc chất sẽ làm thay đổi KTTP của tiểu phân nano polyme. KTTP của các mẫu chứa dƣợc chất đƣợc thể hiện ở hình 3.5.
Hình 3.5. KTTP của các mẫu chứa dƣợc chất với tỷ lệ dƣợc chất và thể tích pha pha loãng khác nhau
Nhận xét:
- KTTP của các mẫu chứa dƣợc chất vẫn tƣơng đối nhỏ và đồng đều (khoảng 200 nm) nhƣng lớn hơn đáng kể so với các mẫu trắng đƣợc bào chế trong cùng điều kiện (khoảng 150 nm). KTTP tăng lên có thể là do sự thay đổi cấu trúc bên trong của tiểu phân nano hoặc do ảnh hƣởng của các dƣợc chất dạng tự do. Tuy nhiên, KTTP không tăng theo tỷ lệ thuận với tỷ lệ dƣợc chất : polyme.
- KTTP của các mẫu dùng 400 ml pha pha loãng có xu hƣớng giảm nhẹ có thể là do sự khuếch tán của dung môi diễn ra nhanh chóng và đồng đều hơn.
3.3.2. Ản ưởn của c c yếu tố lên ệu suất man t uốc
Với các mẫu CT5 và CT6 tỷ lệ dƣợc chất/polyme lớn (2:3): mặc dù KTTP đo đƣợc vẫn ở cỡ nano nhƣng chúng tôi nhận thấy, dịch rửa sau quá trình ly tâm vẫn còn rất đắng, có thể là do bên cạnh tiểu phân nano polyme, dƣợc chất tồn tại nhiều dƣới dạng tự do khó loại trừ hoàn toàn bằng quá trình thiết bị ly tâm-rửa trong điều kiện bộ môn. Dạng tự do còn tồn dƣ này có thể làm thí nghiệm đánh giá hiệu suất mang dƣợc chất không chính xác. Do vậy chúng tôi chỉ lựa chọn các công thức có
0 50 100 150 200 250 300 10% 25% 40% K TTP (n m )
Tỷ lệ khối lượng dược chất : polyme
300 ml 400 ml 1 : 9 1 : 3 2 : 3
Thể tích pha pha loãng
tỷ lệ dƣợc chất 1:9 và 1:3 để xác định hiệu suất mang dƣợc chất từ đó lựa chọn ra công thức tối ƣu để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Hiệu suất mang dƣợc chất của các mẫu CT1, CT2, CT3 và CT4 đƣợc thể hiện ở bảng 3.9.
Bản 3.9. H ợ h ủ ể h Công thức Tỷ lệ dƣợc chất : polyme (tổng khối lƣợng: 1,5 g) Thể tích pha pha loãng (ml)
Hiệu suất mang dƣợc chất (%) CT1 1 : 9 300 46,93 CT2 1 : 9 400 75,9 CT3 1 : 3 300 13,1 CT4 1 : 3 400 36,5 Nhận xét:
Hai mẫu CT1 và CT2 tỷ lệ dƣợc chất : polyme thấp hơn (1:9) có hiệu suất mang dƣợc chất cao hơn các mẫu CT5 và CT6 tỷ lệ dƣợc chất/polyme cao hơn (1:3). Hiện tƣợng này có thể đƣợc giải thích là do tỷ lệ polyme cao làm tăng độ nhớt của giọt pha dầu, giảm hệ số khuếch tán của dƣợc chất. Khi các hạt rắn đã hình thành, tỷ lệ polyme cao cũng làm tăng quãng đƣờng khuếch tán các phân tử dƣợc chất trong tiểu phân tới môi trƣờng, từ đó hạn chế thất thoát dƣợc chất.
Hai mẫu có thể tích pha pha loãng cao hơn (400 ml) có hiệu suất mang dƣợc chất cao hơn (75,9 và 46,93%) so với các mẫu có thể tích pha pha loãng 300 ml (36,5 và 13,1%). Xu hƣớng này có thể là do thể tích pha pha loãng lớn giúp ethyl acetat dễ khuếch tán, các tiểu phân rắn hình thành nhanh chóng. Quá trình khuếch tán từ môi trƣờng rắn sang lỏng sẽ khó khăn hơn khuếch tán lỏng-lỏng giúp giảm hƣ hao dƣợc chất.
Tuy mẫu CT4 có hiệu suất mang dƣợc chất thấp hơn so với 2 mẫu CT1 và CT2 (36,5% so với 75,9 và 46,93%) nhƣng do lƣợng dƣợc chất đầu vào lớn (375 mg so với 150 mg) nên vẫn chứa tổng hàm lƣợng azithromycin là lớn hơn. Do vậy,
mẫu CT4 đƣợc lựa chọn làm công thức để đánh giá tốc độ hoà tan và theo dõi độ ổn định.
3.3.3. Tốc đ o tan của az tromyc n từ t ểu p ân nano
Phép thử tốc độ hoà tan của azithromycin từ tiểu phân nano đƣợc bào chế theo công thức CT4 đƣợc thực hiện theo mục 2.3.2.2.e qua màng thẩm tích kích