Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR)

b. Tổng hợp 7-methyl-2,3-dihydrobenzo [4,5]imidazo [2,1-b]thiazol (III-b)

3.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR)

Phổ 1H-NMR của các chất được trình bày từ phụ lục 11 đến 27. Kết quả biện giải phổ được trình bày trong bảng 9.

Bảng 9. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các chất CTCT Kết quả phân tích III-a Phụ lục 11,12,13,14 1H-NMR(500MHz,MeOD),(ppm): 4,04 (2H, t, J= 7,0 Hz,H- 2’); 4,46 (2H, t, J=7,0 Hz,H- 3’); 7,20 (2H, m, H-5, H-6); 7,35 (1H, dd, J1= 2,5 Hz, J2= 6,5 Hz, H-7); 7,48 (1H, dd, J1= 2,5 Hz, J2= 6,0 Hz, H-4). III-b Phụ lục 15, 16, 17, 18 1H-NMR(500MHz,CDCl3),(ppm): 2,37 (3H, s, H- 4’); 3,84 (2H, t, J=7 Hz,0 Hz, H- 2’); 4,19 (2H, t, J= 7,0 Hz, H-3’); 6,93- 7,01 ( 2H, m, H-6, H-7); 7,33- 7,41 ( 1H, m, H- 4). IV-a Phụ lục 19, 20, 21 1H-NMR(500MHz,D2O),(ppm): 4,20 (2H, t, J= 8,0 Hz,H- 2’); 4,58 (2H, t, J=8,0 Hz,H- 3’); 7,40 (2H, m, H-5, H-6); 7,48 (1H, dd, J1= 3 Hz, J2= 7 Hz, H-7); 7,54 (1H, dd, J1= 2,5 Hz , J2= 6,5 Hz, H-4).

V-a Phụ lục 22, 23, 24 1H-NMR( 500MHz, MeOD), (ppm): 1,90 (2H, 2t, J= 5,0 Hz,H- 3’); 2,21 (2H, t, J=5,5 Hz, J’= 6,0 Hz,H- 4’); 2,92 (2H, t, J= 5,5 Hz, H-2’); 4,40 (2H, t, J= 5 Hz, H-5’); 7,22 ( 1H, dd, J1= 7,5Hz, J2= 8,0Hz, H-5); 7,28 ( 1H, dd, J1= 7,0Hz, J2= 7,5Hz, H-6); 7,46 ( 1H, d, J= 8,0 Hz, H-7); 7,56 ( 1H, d, J= 8,0, Hz, H-4). VI-a Phụ lục 25, 26, 27 1H-NMR( 500MHz, D2O), (ppm): 1,92 (2H, 2t, J= 5,0Hz, H-3’); 2,19( 2H, 2t, J= 5,0 Hz, H-4’); 3,08( 2H, t, J= 5,5Hz, H-2’); 4,48 ( 2H, t, J= 5,0Hz, H-5’); 7,47 ( 2H, m, H-5, H-6); 7,56 ( 1H, dd, J1= 1,5 Hz, J2= 7,0 Hz, H-7); 7,64 ( 1H, d, J =7,5 Hz, H-4).

Nhận xét: Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân trên, nhận thấy sự có mặt của các tín hiệu proton phù hợp với công thức cấu tạo của các chất dự kiến.

Ghi chú: δ: Độ chuyển dịch hóa học được lấy theo giá trị trung bình (ppm),

s: singlet, d: doublet, dd: doublet doublet, t: triplet, m: multiplet.

3.4. Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm

Dựa vào một số nghiên cứu về tác dụng sinh học của các dẫn chất 2- mercaptobenzimidazol, chúng tôi tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của cả 6 chất: II-a, III-a, III-b, IV-a, V-a, VI-a, thực hiện tại bộ môn Vi sinh- Sinh học, Trường Đại học Dược Hà Nội.

3.4.1. Giống vi sinh vật sử dụng

Hoạt tính kháng khuẩn được thực hiện với 5 vi khuẩn Gram (+) và 4 vi khuẩn Gram (-) sau:

+Vi khuẩn Gram (+):

- Staphylococcus aureus ATCC 1128 (S. aureu)

- Bacillus pumilus ATCC 10241 (B. pumilus)

- Bacillus subtilis ATCC 6633 (B. subtilis)

- Bacillus cereus ATCC 9946 (B. cereus) - Sarcina lutea ATCC 9341 (S. lutea)

+ Vi khuẩn Gram (-):

- Escherichia coli ATCC 25922 (E. coli)

- Proteus mirabilis BV 108 (P. mirabilis)

- Shigella flexneri DT 112 (S. flexneri)

-Salmonella typhi DT 220 (S. typhi) + Vi nấm:

- Mốc đen: Aspergillus sp. VSSH 1401 (Asp. 1) - Mốc xanh 1: Aspergillus sp. VSSH 1402 (Asp. 2) - Mốc xanh 2: Paecilomyces sp. VSSH

- Mốc xanh 3: Penicillium sp. VSSH 1501

(Pae. 3) (Pen.1)

3.4.2. Môi trường thử nghiệm

Bảng 10. Môi trường thử nghiệm kháng khuẩn, kháng nấm

Kháng khuẩn Kháng nấm

Canh thang Thạch thường Sabouraud lỏng

- NaCl 0,5% - Cao thịt 0,3% - Pepton 0,5% - Nước cất vừa đủ 100 mL. - NaCl 0,5% - Cao thịt 0,3% - Thạch 1,6% - Pepton 0,5% - Nước cất vừa đủ 100 mL. - Pepton 1 % - Glucose 2% - Thạch 1,6% - Nước cất vừa đủ 100 mL.

3.4.3. Mẫu kháng sinh chuẩn

- Streptomycin: 20 IU/mL đối với vi khuẩn Gram (-).

- Benzathin penicillin: 20 IU/mL đối với vi khuẩn Gram (+).

- Khỏng sinh chống nấm itraconazol 300 µg/mL pha trong methanol.

3.4.4. Phương pháp tiến hành

 Nguyên tắc:

Thử tác dụng kháng khuẩn kháng nấm được tiến hành bằng phương pháp khuếch tán trên thạch. Mẫu thử (có chứa hoạt chất thử) được đặt lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy vi sinh vật kiểm định, hoạt chất từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.  Tiến hành:

- Mẫu thử được pha vào dung môi thích hợp (methanol, H2O) với nồng độ cho cỏc mẫu như sau: II-a: 100 g/mL, III-a: 100 g/mL, III-b: 100 g/mL, VI-a: 100 g/mL, V-a: 100 g/mL, VI-a: 100 g/mL. Các khoanh giấy lọc vô trùng và đã được sấy khô được tẩm với 3 lần với dung dịch mẫu thử, sau mỗi lần tẩm các khoanh giấy lọc có chứa mẫu thử đều được sấy < 60oC đến khô hết dung môi.

phát triển trong tủ ấm 37oC trong thời gian 18-24 giờ đến nồng độ 107 tế bào/mL (kiểm tra bằng pha loãng và dãy dịch chuẩn). Môi trường thạch thường vô trùng (tiệt trùng 118oC/30 phút) được làm lạnh về 45-50oC và được cấy giống VSV kiểm định vào với tỷ lệ 2,5mL/100mL. Lắc tròn để VSV kiểm định phân tán đều trong môi trường thạch thường, rồi đổ vào đĩa petri vô trùng với thể tích 20mL/đĩa và để cho thạch đông lại.

 Vi nấm kiểm được cấy vào môi trường sabouraud lỏng, rồi nuôi cấy cho phát triển trong tủ ấm 28-30oC trong 18-24h đến nồng độ 107 tế bào/mL (kiểm tra bằng pha loãng và dãy dịch chuẩn). Lắc đều để VSV kiểm định phân tán đều trong môi trường thạch, rồi đổ vào các đĩa petri vô trùng với thể tích 20mL/đĩa và để cho thạch đông lại.

- Đặt khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc đã được tẩm chất thử và xử lý như trên được đặt lên bề mặt môi trường thạch thường chứa VSV kiểm định theo sơ đồ định sẵn (với vi nấm thì phải làm 4 thực nghiệm song song).

- Ủ các đĩa petri có mẫu thử được đặt như trên trong tủ ấm ở 37oC trong 18-24h, rồi sau đó lấy ra đọc kết quả, đo đường kính vòng vô khuẩn và vô nấm nếu có (thước kẹp Panmer độ chính xác 0,02mm).

- Đánh giá kết quả: Dựa trên đường kính vòng vô khuẩn, vô nấm và được đánh vòng vô khuẩn, vô nấm được đánh giá theo công thức:

2 1 1 ( ) 1 n n i i i i D D D D s n n        

D: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn, vô nấm Di : Đường kính vòng vô khuẩn hoặc vô nấm thứ i s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh n: Số thí nghiệm làm song song (n= 3)

3.4.5. Kết quả thử nghiệm:

Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của các chất II-a, III-a, III-b,

Bảng 11. Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm

Đặc điểm

Vi khuẩn, vi nấm

III-a IV-a V-a VI-a III-b II-a MC

Gr(+) B. cereus D - - - - ức - 14,51 s - - - 1,36 B. subtilis D ức - - 7,67 7,48 - 13,06 s - - - 0,02 0,1 - 1,24 B. pumilus D - - - 9,58 10,42 2 - 16,2 s - - - 1,74 0,49 - 0,75 S. aureus D - - - - - 16,47 s - - - - - - 0,99 S. lutea D ức - - - - ức 13,43 s - - - 0,92 Gr(-) E. coli D - - ức 8,72 7,83 - 15,52 s - - - 0,96 0,47 - 0,67 P.mirabilis D - - 7,46 8,93 8,89 8,21 13,62 s - - 0,2 0,78 1,07 0,54 4,33 S. flexneri D - - - 7,37 7,67 - 16,22 s - - - 0,25 0,07 - 0,50 S. typhi D 7,48 9,31 ức 9,18 8,16 8,21 17,44 s 0,19 0,43 - 0,81 0,32 0,21 0,57 Vi nấm Asp.1 D - - - - ức - 14,43 s - - - 0,72 Asp.2 D - 9,06 - ức 8,81 - 14,72 s - 0,45 - - 1,71 - 0,89 Pae.3 D - - - - - - - s - - - - Pen.1 D - - - - 9,46 - 13,82 s - - - - 0,48 - 0,95 MC: mẫu chứng Kết luận:

Sau khi đã thử tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm của 6 chất với nồng độ 100 µg/ mL , cho thấy kết quả như sau:

- Mẫu III-a, IV-a và V-a có tác dụng đối với 1/9 vi khuẩn thử. - Mẫu II-a có tác dụng đối với 2/9 vi khuẩn thử.

- Mẫu III-b và VI-a có tác dụng đối với 6/9 vi khuẩn thử.

+ Tác dụng kháng nấm:

- Mẫu IV-a có tác dụng đối với 1/4 vi nấm thử. - Mẫu III-b tác dụng đối với 2/4 vi nấm thử.

3.5. Bàn luận

3.5.1. Về tổng hợp hóa học

3.5.1.1. Phản ứng ngưng tụ tạo nhân 2-mercaptobenzimidazol

Phản ứng tạo nhân 2-mercaptobenzimidazol bằng cách ngưng tụ o-

phenylendiamin và carbondisulfid xảy ra tương đối dễ dàng với hiệu suất khá cao (82,90% và 70%). Sản phẩm thu được ít tạp, dễ tinh chế. Trong phản ứng này kali hydroxyd (KOH) hoạt hóa với carbondisulfid (CS2) và dung môi ethanol để tạo kali ethyl xanthat:

Sau đó kali ethyl xanthat này phản ứng với 1 nguyên tử nitơ của o-

phenylendiamin, tiếp đó diễn ra quá trình ngưng tụ trên phân tử vừa thu được tạo nhân 2- mercaptobenzimidazol: (Xem sơ đồ 17)

Sơ đồ 17. Quá trình tạo dẫn chất 2- mercaptobenzimidazol từ

o-phenylen diamin

Một số yếu tố có thể ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng đóng vòng:

Thông qua nghiên cứu phản ứng này, phản ứng xảy ra tốt nhất khi sử dụng tỷ lệ mol giữa 3 chất là o-phenylendiamin: CS2: KOH (1: 1: 1). Khi tăng hoặc giảm tỷ lệ CS2 hay KOH đều làm giảm hiệu suất phản ứng.

 Nhiệt độ phản ứng:

Nhiệt độ phản ứng có ảnh hưởng đến hiệu suất và thời gian phản ứng, trong đó chúng tôi đã tìm ra nhiệt độ tốt nhất cho phản ứng là 90°C. Nếu nhiệt độ thấp, phản ứng diễn ra chậm và không hoàn toàn. Nếu nhiệt độ quá cao sẽ tạo ra nhiều tạp do phản ứng oxy hóa amin, vì vậy sẽ làm giảm hiệu suất phản ứng.

 Lượng than hoạt sử dụng, nhiệt độ và thời gian tẩy màu:

Thường trong quá trình tẩy màu lượng than hoạt sử dụng tốt nhất là 5- 10% so với lượng sản phẩm, phải lọc lấy sản phẩm khoảng nhiệt độ tốt nhất là 60 oC và thời gian là 10 phút. Việc giảm hoặc tăng lượng than hoạt, nhiệt độ và thời gian sẽ làm giảm hiệu suất phản ứng.

3.5.1.2. Tổng hợp 2, 3-dihydrobenzo [4, 5] imidazo [2, 1-b] thiazol (III-a) và 7-methyl-2, 3-dihydrobenzo [4,5] imidazo [2,1-b]thiazol (III-b)

Đây là phản ứng akyl hóa, phản ứng xảy ra theo cơ chế ái nhân lưỡng phân tử SN2 trong đó có khả năng ái nhân của –SH lớn hơn –NH (xem sơ đồ 18).

Sơ đồ 18. Cơ chế tạo dẫn chất III-a và III-b từ II-a và II-b

 Tỷ lệ mol II-a (II-b): dicloroethan

Tỷ lệ mol này có vai trò quan trọng để nâng cao tính chọn lọc của phản ứng và độ tinh khiết của sản phẩm III-a và III-b. Trong đó, chúng tôi đã dùng tỷ lệ II-a (II-b): dicloroethan= 1:6. Trên thực nghiệm cho thấy nếu dùng lượng dư hoặc vừa đủ

II-a (II-b) trên SKLM quan sát thấy xuất hiện nhiều vết của sản phẩm phụ (xem sơ đồ 19).

Sơ đồ 19. Các sản phẩm phụ có thể có trong phản ứng tổng hợp III-a, III-b

 Thứ tự nạp liệu

Cách thực hiện phản ứng cũng rất quan trọng. Cần nhỏ giọt dung dịch

II-a, II-b (trong isopropanol/ aceton) vào tác nhân dicloroethan. Nếu nhỏ giọt dung

dịch II-a, II-b quá nhanh thì các sản phẩm phụ cũng dễ tạo ra do lượng cục bộ của

II-a, II-b trong khối phản ứng.

3.5.1.2.Tổng hợp 2,3,4,5-tetrahydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b][1,3]thiazepin(V-a)

Cơ chế và các yếu tố ảnh hưởng tới phản ứng tạo ra V-b tương tự như phản ứng tạo ra III-a, III-b trên (xem sơ đồ 20, 21).

Sơ đồ 20. Cơ chế tạo dẫn chất V-a từ II-a

Sơ đồ 21. Quá trình tạo sản phẩm và sản phảm phụ

Chúng tôi nhận thấy phản ứng với 1,4 –dibromobutan tạo ra V-a xảy ra nhanh hơn và cho hiệu suất cao hơn phản ứng tạo ra III-a (43,42%> 30,51%). Điều này là do khả năng phản ứng alkyl hóa và chọn lọc cao hơn (theo SKLM) của dẫn chất brom cao hơn clor tương ứng. Điều khác nữa có thể do năng lượng tạo vòng 7 cạnh thấp hơn so với năng lượng tạo 5 cạnh.

3.5.2. Về kết quả đo phổ

Từ các kết quả dữ liệu phổ IR, phổ MS và phổ cộng hưởng từ proton, chúng tôi đã tổng hợp được các chất III-a, III-b, IV-a, V-a, VI-a như dự kiến.

Khi thử ở nồng độ 100 µg/ mL các chất thể hiện tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm như sau:

+ Tác dụng kháng khuẩn: Cả 6 chất đều có tác dụng kháng khuẩn, tromg đó: mẫu III-

a, IV-a và V-a có tác dụng đối với 1/9 vi khuẩn, mẫu II-a có tác dụng đối với 2/9 vi

khuẩn, mẫu III-b và VI-a có tác dụng đối với 6/9 vi khuẩn.

+ Tác dụng kháng nấm: Mẫu IV-a có tác dụng đối với 1/4 vi nấm thử, mẫu III-b tác dụng đối với 2/4 vi nấm thử.

Theo như kết quả thử tác dụng sinh học cho thấy chất III-b và VI-a có hoạt tính

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

 Từ những kết quả nghiên cứu trình bày trên đây, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:

Đã tổng hợp được 6 chất như: 2-mercaptobenzimidazol (II-a),

2, 3-dihydrobenzo [4, 5] imidazo [2, 1-b] thiazol (III-a),

7-methyl-2, 3-dihydrobenzo [4,5] imidazo [2,1-b]thiazol (III-b), 2, 3-dihydrobenzo [4,5] imidazo [2,1-b] thiazol hydroclorid (IV-a), 2,3,4,5-tetrahydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b][1,3]thiazepin ( V-a),

2,3,4,5-tetrahydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b][1,3]thiazepin hydroclorid (VI-a). Dựa trên phương pháp SKLM, đo nhiệt độ nóng chảy và dữ liệu phân tích phổ MS, phổ IR và phổ 1H-NMR, chúng tôi đã xác định được cấu trúc của 5 chất tổng hợp được phù hợp với cấu trúc dự kiến.

Đã thử tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm của 4 chất: chất II-a, III-a, III-b, IV-a,

V-a, VI-b. Trong đó các mẫu có tính kháng khuẩn như sau: mẫu III-a, IV-a và V-a

có tác dụng đối với 1/9 vi khuẩn thử, mẫu II-a có tác dụng đối với 2/9 vi khuẩn thử, mẫu III-b và VI-a có tác dụng đối với 6/9 vi khuẩn thử. Còn tác dụng kháng nấm: mẫu IV-a có tác dụng đối với 1/4 vi nấm thử, mẫu III-b tác dụng đối với 2/4 vi nấm thử.

 Kiến nghị

Với kết quả đạt được, chúng tôi hy vọng nghiên cứu này có thể đóng góp một phần vào việc làm phong phú hơn về tổng hợp và thử tác dụng sinh học của dẫn chất 2- mercaptobenzimidazol ở Việt Nam. Để tiếp tục phát triển kết quả của khóa luận này, chúng tôi đưa ra một số đề xuất sau:

1. Tiếp tục tổng hợp và thử tác dụng sinh học của các dẫn chất 2- mercaptobenzimidazol với các nhóm thế khác nhau ở vị trí C5, C6 và N1 trên nhân benzimidazol.

2. Tiếp tục thử nghiệm các hoạt tính sinh học triển vọng của dẫn chất 2- mercaptobenzimidazol như tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn, gây độc trên tế bào ung thư, kháng virus, diệt ký sinh trung… nhằm góp phần tìm ra các dẫn chất mới có tác dụng sinh học triển vọng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Nam:

1. Nguyễn Đình Luyện (2009), Kĩ thuật tổng hợp hóa dược I, Trường Đại học

Dược Hà Nội, trang 48-54.

2. Nguyễn Hữu Đình, Trần Thị Đà (1999), Ứng dụng một số phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử, Nhà Xuất bản Giáo Dục, Hà Nội.

3. Trần Đức Hậu (2007), Hoá Dược tập I, Nhà xuất bản Y học Hà Nội.

Tiếng Anh:

4. Mohd R. et al. (2012), "Synthesis of benzimidazoles bearing oxadiazole nucleus as anticancer agents", European Journal of Medicinal Chemistry, 54, pp. 855- 866.

5. Achar Kavitha C.S., Hosamani Kallappa M., Seetharamareddy Harisha R. (2010), "In-vivo analgesic and anti- inflammatory activities of newly synthesized benzimidazole derivatives" European Journal of Medicinal Chemistry, 45(5), pp.2048-2054.

6. Aoki Kozo, Aikawa Kazuhiro (1999), "2-mercaptobenzimidazole derivatives and antihyperlipemic agent or antiarteriosclerotic agent containing the same",

United States Patent Office, 5 962 493, pp. 1-52.

7. El-Sharief A. M. Sh., et al. (2002), "Reactivity of cyanothioformamides and 3- (4-Bromophenyl)-5-imino-4-oxazolidinethione toward ortho-substituted nucleophiles", Heteroatom Chemistry, 13(7), p.611-616.

8. VanAllan J. A. et al. (1950), “2-mercaptobenzimidazol”, Organic Syntheses,

30, p.56.

9. Wang Maw-Ling, Liu Biing-Lang (1995), "Reaction of carbon disulfide and o- phenylenediamine catalyzed by tertiary amines in a homogeneous solution",

Ind. Eng. Chem. Res., 34(11), pp. 3688-3695.

10.Wang Maw-Ling, Liu Biing-Lang (1995), Semi-continuous gas-liquid catalyzed reaction of o-phenylene diamine and carbon disulfide by tertiary amines, Hung Kuang University, Taiwan, pp. 1-18.