a. Nghiên cứu và tổng hợp các dẫn chất 2- mercaptobenzimidazol Bảng 4. Công thức các chất dự kiến tổng hợp dược.
Công thức cấu tạo Tên khoa học
(II-a) 1H-benzo[d]imidazol-2-thiol (II-b) 5-methyl-1H- benzo[d]imidazol-2-thiol (III-a) 2,3- dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1- b]thiazol (III-b) 7-methyl-2,3- dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1- b]thiazol (IV-a) 2,3- dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1- b]thiazol hydroclorid
(V-a)2,3,4,5- tetrahydrobenzo[4,5]imidazo[2,1- b][1,3]thiazepin (VI-a)2,3,4,5- tetrahydrobenzo[4,5]imidazo[2,1- b][1,3]thiazepin hydroclorid
b. Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được. c. Thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của một số dẫn chất tổng hợp được. 2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Tổng hợp hóa học
Tổng hợp hóa học thực hiện tại Phòng Tổng hợp Hóa dược, Bộ môn Công nghiệp Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội.
Sử dụng các phương pháp thực nghiệm cơ bản trong hóa học hữu cơ để tổng hợp các chất dự kiến: phản ứng ngưng tụ, S-alkyl hóa, O-alkyl hóa, phản ứng thủy tạo muối …
Sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) với bản mỏng silicagel GF254 Merck 70-230 mesh và hệ dung môi cụ thể, quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng λ= 254nm để theo dõi tiến triển của phản ứng và xác định sơ bộ xác định độ tinh khiết.
Sử dụng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt để sơ bộ định tính và xác định độ tinh khiết.
2.3.2. Xác định cấu trúc
Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được dựa trên kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR), Phổ khối lượng phân tử (MS), Phổ cộng hưởng tử hạt nhân (1H- NMR).
Phổ ngoại (IR):
Được ghi tại phòng Phân tích hữu cơ – Viện hóa học Việt Nam, trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-400 cm-1. Mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1:200 rồi ép dưới dạng viên nén dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm.
Phổ khối lượng phân tử (MS) :
Được ghi theo phương pháp ESI trên máy LTQ Orbitrap XL tại Phòng Hóa vật liệu - Khoa Hóa - Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, và tại Phòng Phân tích phổ - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam được ghi trên máy LC/MSD Trap - SL và máy LC/MS/MS-Xevo TQ.
- Chế độ đo: ESI-MS dương, và ESI-MS âm. - Dung môi đo: Methanol và nước.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H - NMR):
Được ghi trên máy Brucker AV-500MHz tại Phòng Phân tích phổ - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Dung môi đo: MeOD, D2O
- Chất chuẩn: tetramethylsilan (TMS)
2.3.3. Thử tác dụng sinh học tính kháng khuẩn, kháng nấm
Thử hoạt tính kháng, khuẩn kháng nấm được thực hiện tại bộ môn Vi sinh – Sinh học, Trường Đại học Dược Hà Nội, theo phương pháp khuếch tán trên thạch.
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. Tổng hợp hóa học
Thông qua các tài liệu tham khảo và dựa vào điều kiện của phòng thí nghiệm, các hóa chất cho phép, chúng tôi đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất của 2- mercaptobenzimidazol đi từ nguyên liệu ban đầu là o-phenylendiamin và 5-methyl- 2-mercaptobenzimidazol đi từ nguyên liệu ban đầu là 4-methyl-o-phenylendiamin. Theo sơ đồ như sau: (Xem sơ đồ 10)
3.1.1. Tổng hợp 2-mercaptobenzimidazol (II-a) và 5-methyl-2-mercaptobenzimidazol (II-b) mercaptobenzimidazol (II-b)
2-Mercaptobenzimidazol (II-a) và 5-methyl-2-mercaptobenzimidazol (II-b) được tổng hợp từ o-phenylendiamin và 4-methyl-o-phenylendiamin theo phương pháp của Van Allan và Deacon [8] theo sơ đồ như sau:
Nguyên lý phản ứng: (Xem sơ đồ 11)
Sơ đồ 11. Tổng hợp các chất II-a và II-b
a. Tổng 2-mercaptobenzimidazol (II-a)
Chuẩn bị thí nghiệm:
- Chuẩn bị một số dụng cụ cần thiết bao gồm:
Một bình cầu 2 cổ 250 mL, ống đong 100 mL, bếp ôm, quả bóp, đá bọt, hệ thống sinh hàn hồi lưu. Cố định bình cầu và hệ thống sinh hàn lên giá đỡ.
- Hóa chất:
O-phenylendiamin, KOH, carbon disulfid, ethanol, than hoạt, dung dịch HCl 5M,
nước cất.
Tiến hành phản ứng:
Đầu tiên cho vào bình cầu hỗn hợp gồm có: 9,72g (0,09 mol) o-
phenylendiamin và 5,04g (0,09 mol) KOH, 98 mL ethanol, 17 mL nước cất. Sau đó nho thêm từ từ 5,55 mL (0,09 mol) carbon disulfid vào bình cầu và thêm vài viên đá bọt (để làm trung tâm sôi cho hỗn hợp phản ứng sôi đều). Tiến hành hồi lưu trong khoảng thời gian 3 giờ. Theo dõi tiến triển phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi cloroform: methanol = 9:1 và phát hiện vết bằng đèn tử ngoại ở bước song λ= 254 nm.
Xử lý phản ứng:
Sau khi phản ứng kết thúc, thêm vào hốn hợp phản ứng 1,2g than hoạt, tiếp tục đun trong 10 phút, lọc nóng và nhanh hỗn hợp bằng phễu lọc Buchner, rửa lại 2 lần bằng ethanol nóng. Thêm 65 mL nước nóng (60- 70oC), acid hóa bằng HCl 5M đến pH 6-7 xuất hiện tủa, tiếp tục khuấy 1 giờ. Lọc lấy tủa, rửa lại 3 lần bằng nước cất. Tinh chế lại bằng cách làm kết tinh trong ethanol 50%. Lọc tủa, sấy sản phẩm khô ở 70- 80 oC.
Kết quả:
- Cảm quan: Tinh thể hình phiến mỏng, màu trắng ánh bạc. - Khối lượng: 11, 2 g
- Hiệu suất: 82,90 %
-Độ tan: Tan tốt trong ethanol, aceton, DMF, DMSO; tan trong methanol, dicloromethan; không tan trong nước.
- Rf = 0,30 (Khai triển SKLM trong dung môi cloroform: methanol = 9:1). - To
nc = 300oC – 306oC.
b. Tổng hợp 5-methyl-2-mercaptobenzimidazol (II-b)
Tiến hành và xử lý phản ứng:
5-methyl-2-mercaptobenzimidazol (II-b) được tổng hợp theo quy trình tương tự như tổng hợp 2-mercaptobenzimidazol (II-a). Quá trình thực hiện phản ứng với 3g (0,025 mol) 4-methyl-o-phenylendiamin, 1,4 g (0,025mol) KOH, 1,6 mL carbon disulfid (0,25 mol), 30 mL ethanol tuyệt đối, 5 mL nước cất.
Kết quả:
- Cảm quan sản phẩm: Tinh thể hình phiến, màu trắng hơi nâu tím - Khối lượng: 2,85g
- Hiệu suất: 70,0%
-Độ tan: Tan tốt trong ethanol, aceton, DMF, DMSO, tan trong methanol, dicloromethan; không tan trong nước.
- To
nc = 290 – 292 oC.
3.1.2. Tổng hợp 2, 3-dihydrobenzo [4, 5] imidazo [2, 1-b] thiazol (III-a) và 7-methyl-2, 3-dihydrobenzo [4,5] imidazo [2,1-b]thiazol (III-b) 7-methyl-2, 3-dihydrobenzo [4,5] imidazo [2,1-b]thiazol (III-b)
Nguyên lý phản ứng : (Xem sơ đồ 12)
Sơ đồ 12. Tổng hợp các chất III-a và III-b
a. Tổng hợp 2, 3-dihydrobenzo [4, 5] imidazo [2,1-b] thiazol (III-a)
Chuẩn bị thí nghiệm
- Chuẩn bị một số dụng cụ cần thiết bao gồm: Một bình cầu 2 cổ 250 mL có nút mài, một bình cầu một cổ 100 mL, bình nhỏ giọt 50 mL, ống đong 50 mL, pipet chia vạch 10 mL, quả bóp, cốc có mỏ 50 mL, bình chiết, đũa thủy tinh, máy khuấy từ có gia nhiệt, con khuấy từ, nhiệt kế, cân kỹ thuật, giấy đo pH, hệ thống sinh hàn và máy cất quay chân không Buchi R210. Cố định bình cầu chứa con khuấy từ và lắp đặt hệ thống sinh hàn lên giá đỡ.
- Hóa chất: 2-mercaptobenzimidazol, NaHCO3, 1,2-dicloroethan, dung dịch KOH 20%, dung dịch KOH 15%, isopropanol, cloroform, Na2SO4, nước cất.
Tiến hành phản ứng :
Cho 6,8g (0,08 mol) NaHCO3 và 50 mL isopropanol vào bình cầu 100 mL, thêm 9,4g (0,1 mol) của 1,2-dicloroethan, đun sôi khoảng 1 giờ. Hòa tan trong cốc có mỏ hỗn hợp gồm: 2,5g (0,016mol) 2-mercaptobenzimidazol trong 45 mL isopropanol và 8 mL KOH 20%. Chuyển hỗn hợp vào bình nhỏ giọt và bắt đầu nhỏ rất từ từ vào hỗn hợp phản ứng đun sôi ở trên. Thời gian đun sôi thêm khoảng 5 giờ.
Theo dõi tiến triển phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi cloroform : methanol (9 : 1) và hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng λ= 254nm.
Xử lý hỗn hợp phản ứng :
Sau khi phản ứng kết thúc, đổ hỗn hợp phản ứng vào bình một cổ và cất gần kiệt dung môi isopropanol bằng máy cất quay chân không Buchi R210. Hòa tan hỗn hợp còn lại trong dung môi hữu cơ cloroform 200 mL. Rửa lại 3 lần bằng KOH 15% và kiểm tra pH dịch rửa để đạt khoảng 10-11, sau đó rửa thêm 3 lần bằng nước cất 50 mL/lần, kiểm tra pH nước rửa đạt khoảng 6-7. Chạy SKLM để kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm. Trong dung môi cloroform làm khan nước bằng Na2SO4, rồi lọc lấy dịch và cất quay chân không đến khô, thu hồi dung môi.
Kết tinh lại sản phẩm trong hỗn hợp methanol: nước (tỷ lệ 1:1). Lọc lấy tinh thể và sấy khô trong tủ sấy nhiệt độ 70- 80 oC.
Kết quả :
- Cảm quan: Bột màu trắng hoặc trắng hơi vàng
- Độ tan: Không tan được trong nước, tan trong aceton, methanol, cloroform. - Rf = 0,76 (Khai triển trong hệ dung môi cloroform : methanol = 9 :1) - Hiệu suất = 30,51%
- T0 nc = 108- 111oC.
b. Tổng hợp 7-methyl-2, 3-dihydrobenzo [4, 5] imidazo [2,1-b]thiazol (III-b)
Tiến hành phản ứng:
7-methyl-2,3-dihydrobenzo [4,5] imidazo [2,1-b] thiazol (III-b) được tổng hợp theo quy trình tương tự như tổng hợp 2,3-dihydrobenzo [4,5] imidazo [2,1-b] thiazol (III-a) trên.
Cho 1,7g (0,02 mol) NaHCO3 và 15 mL isopropanol vào bình cầu 100 mL, thêm 2,4g (0,024 mol) của 1,2-dicloroethan và tiến hành đun sôi khoảng 1 giờ. Hòa tan trong cốc có mỏ hỗn hợp 0,65g (0,004 mol) 5-methyl-2-mercaptobenzimidazol trong 10 mL isopropanol và 2 mL KOH 20%. Chuyển hỗn hợp vào bình nhỏ giọt và bắt đầu nhỏ rất từ từ vào hỗn hợp phản ứng đun sôi ở trên. Thời gian đun sôi thêm khoảng 5 giờ.
Theo dõi tiến triển phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi cloroform - methanol (9 : 1) và hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng λ= 254nm.
Xử lý hỗn hợp phản ứng : Cách xử lý tương tự như tổng hợp 2,3-dihydrobenzo
[4,5] imidazo [2,1-b] thiazol (III-a). Kết quả :
- Cảm quan: Bột màu trắng hơi vàng
- Độ tan: Không tan được trong nước, tan trong aceton, methanol, cloroform.
- Rf = 0,80 (Khai triển SKLM trong hệ cloroform - methanol 9 :1)
- Hiệu suất : 34, 52%
- T0 nc = 87- 90 0C.
3.1.3 Tạo muối 2, 3-dihydrobenzo [4,5] imidazo [2,1-b] thiazol hydroclorid (IV-a) (IV-a)
Nguyên lý phản ứng: (Xem sơ đồ 13)
Sơ đồ 13. Tổng hợp chất IV-a
Tiến hành, xử lý phản ứng:
Hòa tan 0,3g (0,0017 mol) III-a trong 5 mL methanol trong bình cầu 100 mL. Sau đó nhỏ từ từ 5 mL (0,16 mol) HCl đặc vào bình phản ứng. Để hỗn hợp 15 phút ở nhiệt độ phòng.
Cất quay hỗn hợp bằng máy cất quay chân không Buchi R210đến cắn. Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM hệ chloroform: methanol (9:1), Sấy sản phẩm V-a trong tủ sấy, nhiệt độ 70-80 oC.
Kết quả:
- Cảm quan: Bột màu trắng.
- Độ tan: Tan tốt trong nước, Khó tan trong cloroform, dicloromethan.
- Rf = 0,76 (Hơ NH3, khai triển SKLM trong hệ cloroform : methanol = 9 :1)
- Khối lượng : 0,36 g
- T0 nc = 142- 144 0C.
3.1.4. Tổng hợp 2,3,4,5-tetrahydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b][1,3]thiazepin (V-a)
Nguyên lý phản ứng: (Xem sơ đồ 14)
Sơ đồ 14. Tổng hợp các chất V-a và V-b
a.Tổng hợp 1,4-dibromobutan
Nguyên lý phản ứng theoVogel’s Textbook of Practical Organic Chemistry trang 390 [15]: (Xem sơ đồ 15)
Sơ đồ 15. Tổng hợp 1,4-dibromobutan
Chuẩn bị thí nghiệm
- Dụng cụ bao gồm: Một bình cầu 250 mL, 3 pipet 10 mL, găng tay, quả bóp, bếp bọc, đá bọt, hệ thống sinh hàn thích hợp, bộ cất thủy tĩnh.
- Hóa chất: acid hydrobromic 40%, acid sulfuric đặc, tetrahydrofuran, natri carbonat, natri sulfat, nước cất.
Tiến hành phản ứng:
Thêm vào bình cầu 142 mL acid hydrobromic 40%, tiếp theo nhỏ từ từ 34,5 mL acid sulfuric đặc, sau đó thêm 17,2 mL tetrahydrofuran và thêm vào vài viên đá bọt. Lắc nhẹ và lắp bình cầu vào bếp bọc với hệ thống sinh hàn thích hợp. Tiến hành hồi lưu trong 3 giờ.
Phản ứng kết thúc, khối phản ứng được để nguội và đổ hỗn hợp phản ứng sang bình chiết 250 mL, gạn lấy lớp dưới vào cốc có mỏ, rửa 2 lần với khoảng 70 mL nước cất, tiếp với 70 mL natri carbonat bão hòa, rửa tiếp với khoảng 70 mL nước cất đến khoảng pH =7. Gạn lấy pha hữu cơ vào bình nón 50 mL, làm khan bằng Na2SO4. Cất sản phẩm ở nhiệt độ t0 = 198 0C và đậy nắp kín, bảo quản trong tủ hút.
Kết quả:
- Cảm quan sản phẩm: Dạng lỏng, trong suốt, hơi vàng. - Thể tích= 11 mL (19,89g).
- Hiệu suất= 43,42 %.
b. Tổng hợp 2,3,4,5-tetrahydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b][1,3]thiazepin ( V-a)
Chuẩn bị thí nghiệm :
- Chuẩn bị dụng cụ bao gồm :
Một bình cầu 2 cổ 250 mL có nút mài, một bình cầu một cổ 100 mL, bình nhỏ giọt 100 mL ,ống đong 50 mL, pipet chia vạch 1 mL, quả bóp, cốc có mỏ 100 mL, bình chiết , đũa thủy tinh, máy khuấy từ có gia nhiệt, con khuấy từ, nhiệt kế, cân kỹ thuật , giấy đo pH, hệ thống sinh hàn và máy cất quay chân không Buchi R210. Cố định bình cầu chứa con khuấy từ và lắp đạt hệ thống sinh hàn lên giá đỡ.
- Hóa chất :
1,4- dibromobutan, K2CO3, aceton, 2-mercaptobenzimidazol, nước cất. Tiến hành phản ứng :
Cho 1,4g (0,01 mol) K2CO3, 20 mL aceton và 0,6 mL (0,005 mol) 1,4- dibromobutan vào bình cầu đã lắp lên giá đỡ. Hòa tan hỗn hợp 0,8g (0,005 mol) của 2-mercaptobenzimidazol trong 80 mL aceton, hòa tan xong đổ vào bình nhỏ giọt. Lắp bình nhỏ giọt lên bình cầu và bắt đầu nhỏ rất từ từ và đun sôi thêm khoảng 8 giờ.
Theo dõi tiến triển phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi cloroform : methanol (9 : 1) và hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng λ= 254nm.
xử lý hỗn hợp phản ứng :
Sau khi phản ứng kết thúc, đổ hỗn hợp phản ứng vào bình một cổ và cất gần kiệt dung môi aceton bằng máy cất quay chân không Buchi R210. Hòa tan hỗn hợp còn lại trong dung môi hữu cơ cloroform 100 mL. Rửa lại 3 lần bằng KOH 15% và kiểm tra pH dịch rửa để đạt khoảng 10-11, sau đó rửa thêm 3 lần bằng nước cất 25 mL/lần, kiểm tra pH nước rửa đạt khoảng 6-7. Chạy SKLM để kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm. Trong dung môi cloroform làm khan nước bằng Na2SO4, rồi lọc lấy dịch và cất quay chân không đến khô, thu hồi dung môi.
Kết tinh lại sản phẩm trong hỗn hợp methanol - nước (tỷ lệ 1:1). Lọc lấy tinh thể và sấy khô trong tủ sấy nhiệt độ 70- 80 oC.
Kết quả :
- Cảm quan: Bột màu trắng hình kim
- Độ tan: Không tan được trong nước, tan trong aceton, methanol,cloroform. - Rf = 0,78 (Khai triển SKLM trong hệ dung môi 9 :1)
- Hiệu suất : 41,36% - T0 nc = 131-133oC.
3.1.5. Tạo muối 2,3,4,5-tetrahydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b][1,3]thiazepin hydroclorid (VI-a) hydroclorid (VI-a)
Nguyên lý phản ứng : (Xem sơ đồ 16)
Sơ đồ 16. Tổng hợp chất VI-a
Tiến hành phản ứng:
Hòa tan 0,34g (0,0017 mol) V-a trong 5 mL methanol trong bình cầu 100 mL. Sau đó nhỏ từ từ 5 mL (0,16 mol) HCl đặc vào bình phản ứng. Để hỗn hợp 15 phút trong nhiệt phòng.
Cất quay hỗn hợp bằng máy cất quay chân không Buchi R210đến cắn. Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM hệ cloroform: methanol - (9:1), Sấy sản phẩm VI-a trong tủ sấy nhiệt độ 70-80 oC.
Kết quả:
- Cảm quan: Bột màu trắng hơi vàng
- Độ tan: Tan tốt trong nước, khó tan trong dung môi hữu cơ như cloroform, dicloromethan, diethylether.
- Rf = 0,76 (Hơ NH3, khai triển SKLM trong hệ cloroform : methanol = 9 :1) - Khối lượng : 0,40 g
- Hiệu suất = 100% - T0 nc = 178- 180 0C.
Bảng 5. Kết quả tổng hơp hóa học
Chất CTPT Cảm quan Hiệu Suất
III-a C9H8N2S Bột màu trắng hoặc hơi vàng 30, 51%
III-b C10H10N2S Bột màu trắng hơi vàng 34, 52%
IV-a C9H8N2S.HCl Bột màu trắng 100%
V-a C11H12N2S Bột màu trắng hình kim 43, 42%
VI-a C11H12N2S.HCl Bột màu hơi vàng 100%
3.2. Kiểm tra độ tinh khiết
Các chất sau khi được tổng hợp, tiến hành kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) và đo nhiệt độ nóng chảy.
SKLM được tiến hành trên bản nhôm tráng sẵn silicagel Merck 70-230 mesh, quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm với dung môi hòa tan ethanol hay aceton, hệ dung môi khai triển: cloroform: methanol (9: 1), soi dưới đèn tử ngoại ở bước song λ= 254nm để quan sát vết sắc ký.
Đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt: 5 chất sau khi tinh chế đều có dạng chất rắn, được sấy khô và đo nhiệt độ nóng chảy để xác định khoảng nhiệt độ nóng chảy của từng chất.
Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (tonc) của các chất được tóm tắt trong bảng 6.
Bảng 6. Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (to