3.3.2.1. Lựa chọn thời gian hấp phụ CS
Tiểu phân nano ART-PLGA/CS bào chế theo quy trình mục 2.3.1.b, cố định t lệ CS/PLGA=0,4, pH dung dịch CS bằng 3,0 và nhiệt độ giai đoạn hấp phụ CS là
25oC. Thời gian hấp phụ CS được khảo sát từ 10 phút đến 720 phút (12 giờ), kết quả đánh giá sự thay đổi về KT, phân bố KTTP và thế zeta của tiểu phân nano ART-PLGA/CS được thể hiện hình 3.2.
Hình 3.2. nh hư ng của thời gian hấp phụ CS đến KTTP, thế zeta và PDI của tiểu phân nano ART-PLGA/CS
Nhận xét: Thời gian hấp phụ CS không ảnh hư ng rõ rệt đến các đặc tính lý học của
tiểu phân nano ART-PLGA/CS, KTTP nano với thời gian hấp phụ CS 10 phút là 187,8 nm và 720 phút là 195,8 nm. Thế z ta cũng thay đổi không đáng kể (từ 36,5 mV đến 33,7 mV). Có thể dự đoán rằng, quá trình hấp phụ CS lên bề mặt tiểu phân nano PLGA diễn ra tức thời. Kết quả này tương tự với kết quả mà Barbault-Foucher S. và cộng sự đã công bố khi nghiên cứu quá trình hấp phụ của acid hyaluronic (một polysaccharid mang điện âm) lên tiểu phân nano polycaprolacton (một tiểu phân nano mang điện dương [8].Do đó, để tránh thời gian quá dài có thể ảnh hư ng đến độ ổn định của dược chất và tính bền vững của hệ nano sử dụng polym phân hủy inh học [10], [41], đồng thời đảm bảo có thể hấp phụ tối đa lượng chitosan, thời gian hấp phụ chito an được lựa chọn là 20 phút cho các khảo sát tiếp theo.
3.3.2.2. Lựa chọn nhiệt độ hấp phụ CS
Tiểu phân nano PLGA bao chất diện hoạt hay polyme về cơ bản là một hiện tượng bề mặt, bất kể quá trình hấp phụ có bản chất vật lý hay hóa học. Th o đó, sự hấp phụ các chất đa điện phân (polyelectrolyte) như chito an, acid hyaluronic lên bề mặt tiểu phân nano có thể bị ảnh hư ng b i các yếu tố như mật độ điện tích, kích
187.8 185 186.4 187 190 191.3 195.8 36.5 36.1 35.9 36.7 37 35.1 33.7 0.000 0.100 0.200 0.300 0 50 100 150 200 250 10 20 30 60 120 180 720 P DI T h ế z eta (m V) T T P (nm ) Thời gian ( hút) KTTP Thế ta PDI
thước tiểu phân, pH, lực ion và nhiệt độ [26], [40]. Ngoài ra, hiện tượng hấp phụ còn có thể được nghiên cứu theo mô hình nhiệt động học hay động học [26]. Nhiệt độ ảnh hư ng đến độ nhớt của dung dịch, do đó ảnh hư ng đến khả năng phân tán đồng đều của các tiểu phân nano. Tăng nhiệt độ làm giảm độ nhớt của hệ nhưng làm tăng chuyển động nhiệt của các hạt k o, làm tăng khả năng kết tập tiểu phân tạo các tiểu phân k ch thước lớn. Nhiệt độ cao (trên 40oC) còn ảnh hư ng đến tính bền vững của dược chất [5]. Do đó, qua thực nghiệm và tham khảo tài liệu, khoảng nhiệt độ từ 10-40oC được lựa chọn.
3.3.3. Tối ưu hóa công thức bào chế tiểu phân nano ART-PLGA/CS
3.3.3.1. Thiết kế thí nghiệm
Sau khi khảo át ơ bộ nhận thấy: t lệ CS/PLGA, pH dung dịch CS, nhiệt độ giai đoạn hấp phụ CS có ảnh hư ng mạnh tới các đặc tính tiểu phân nano ART- PLGA/CS. Vì vậy, các thông số trên được lựa chọn là các biến đầu vào và tiến hành thiết kế thí nghiệm với công thức như au
Pha dầu: 5 ml DCM chứa ART 0,4% và PLGA 1% Pha nước: 50 ml dung dịch Tween 80 1,5%
Dung dịch CS: 50 ml dung dịch CS, trong đó
T lệ CS/PLGA (kl/kl) thay đổi từ 0,2 đến 1,0 pH dung dịch CS thay đổi từ 3,0 đến 5,0
Tiểu phân nano ART-PLGA/CS được bào chế theo quy trình trình bày mục 2.3.1.b, cố định thời gian hấp phụ CS là 20 phút và nhiệt độ giai đoạn hấp phụ CS thay đổi từ 10 đến 40o
C.
a. Các biến độc lập
Các biến đầu vào được lựa chọn bảng 3.4.
Bảng3.4. Ký hiệu và các mức của biến độc lập
Tên biến định
lượng Ký hiệu Đơn vị
M c dưới (-1) M ơ bản (0) M c trên (+1) T lệ CS/PLGA CS/PLGA - 0,2 0,6 1,0 pH dung dịch CS pH dd CS - 3,0 4,0 5,0 Nhiệt độ hấp phụ To oC 10 25 40
b. Các biến phụ thuộc
Sự phân bố của tiểu phân nano trong cơ thể phụ thuộc chủ yếu vào 2 đặc tính lý hóa quan trọng là k ch thước tiểu phân và đặc tính bề mặt tiểu phân [25].
Nhiều tài liệu cho rằng tiểu phân nano k ch thước từ 100-200 nm và đồng nhất về phân bố k ch thước là th ch hợp ử dụng th o đường tĩnh mạch để tránh nguy cơ tắc mạch và cho thời gian tuần hoàn kéo dài [4], [32]. Ngoài ra TTP nhỏ hơn 200 nm là cần thiết để tránh hiệu ứng lọc lách [36] và tăng t ch lũy thuốc vào các khối u rắn thông qua hiệu ứng EPR [4], [41].
iên quan giữa điện thế bề mặt tiểu phân k o đến độ ổn định vật l của hỗn dịch keo nano, độ lớn thế ta trên 30 mV (âm hoặc dương được cho là giúp duy trì độ ổn định của hệ do tăng lực đẩy tĩnh điện giữa các tiểu phân, giảm nguy cơ kết tập các hạt k o do lực hút Van d r aal [28], [47]. Tuy nhiên, thế ta dương quá cao có thể là nguyên nhân làm tăng ự hấp phụ prot in (quá trình op onin hóa lên bề mặt tiểu phân nano, làm tăng ự nhận diện b i hệ thống thực bào [6].
Ngoài ra, 1 hệ đưa thuốc tốt cần có hiệu suất mang thuốc cao để giúp bảo vệ tối đa DC khỏi các điều kiện bất lợi và tăng hiệu quả điều trị.
Do đó, để cân bằng các điều kiện, các biến phụ thuộc và yêu cầu của chúng được lựa chọn th o bảng 3.5.
Bảng 3.5. Ký hiệu và các mức của biến phụ thuộc
Biến phụ thuộc Ký hiệu Đơn vị Yêu cầu
KTTP trung bình KTTP nm <200
Chỉ số đa phân tán PDI - <0,300
Thế zeta Zeta mV 30 Z ta ≤40
Hiệu suất mang thuốc EE % Cao nhất
c. Thiết kế thí nghiệm
Sử dụng phần mềm M DDE 8.0 để thiết kế thí nghiệm theo thiết kế hợp tử tại tâm, với 3 biến đầu vào cho 18 thí nghiệm và 3 thí nghiệm bổ ung được trình bày phụ lục 1.
Tiến hành bào chế tiểu phân nano ART-PLGA/CS th o phương pháp ghi mục 2.3.1.b.
Sau khi bào chế, tiến hành đánh giá các đặc tính tiểu phân ch thước tiểu phân, chỉ số đa phân tán, thế zeta, hiệu suất mang thuốc th o phương pháp mục 2.3.2.2. Kết quả được trình bày phụ lục 2.1 và 2.2.
Nhận xét: Các mẫu nano ART-PLGA/CS thu được đều có k ch thước tiểu phân trong khoảng 180-320 nm, chỉ số đa phân tán nhỏ hơn 0,300, thế ta trên 20 mV, hiệu uất mang thuốc trên 50%. Các thông ố này phụ thuộc nhiều vào t lệ thành phần trong công thức và các thông ố quá trình.
3.3.3.2. Phân tích các yếu tố ảnh hư ng
a. Xử lý kết quả bằng phần mềm FormRules v2.0
Ảnh hư ng của các biến độc lập đến các biến phụ thuộc au khi được xử lý bằng phần mềm FormRules v2.0 được trình bày bảng 3.6 và phụ lục 3.
Bảng 3.6. nh hư ng của các biến độc lập đến biến phụ thuộc
Biến phụ thuộc
Biến độc lập KTTP PDI Zeta EE
T lệ CS/PLGA + + + -
pH dung dịch CS + + + +
Nhiệt độ hấp phụ + + + -
“+”: có ảnh hư ng “-”: không ảnh hư ng
Nhận xét: Từ kết quả bảng 3.6 và phụ lục 3 cho thấy
ch thước tiểu phân trung bình, chỉ số đa phân tán và thế ta phụ thuộc vào t lệ CS/PLGA, pH dung dịch C và nhiệt độ hấp phụ C . Trong khi đó, hiệu uất mang thuốc phụ thuộc chủ yếu vào pH dung dịch CS.
b. Xử lý kết quả bằng phần mềm InForm v3.1
- Để hiểu rõ hơn về sự ảnh hư ng của các biến độc lập đến biến phụ thuộc, kết quả tiếp tục được xử lý bằng phần mềm InForm v3.1.
- Kết quả luyện mạng neuron nhân tạo được trình bày bảng 3.7, R2 luyện đều lớn hơn 80% chứng tỏ mạng neuron nhân tạo mô tả chính xác mối quan hệ giữa biến độc lập và biến phụ thuộc.
ảng3.7. ết quả u ện mạng n uron nhân tạo
iến hụ
th ộ Số đơn vị đầ và vị đầ ra Số đơn vị lớ ẩn Số đơn Số lần l yện
R2 l yện (%) KTTP 3 1 1 1000 95,95 PDI 3 1 1 1000 81,27 Zeta 3 1 1 1000 95,69 EE 3 1 1 1000 94,33
Phân tích một số mặt đá để thấy rõ x hướng ảnh hưởng của biến độc lập vào biến phụ thuộc:
- Ảnh hư ng của pH dung dịch CS và t lệ CS/PLGA đến KTTP nano ART- PLGA/CS
Hình 3.3. Mặt đáp biểu diễn sự ảnh hư ng của pH dung dịch CS và tỷ lệ CS/PLGA đến KTTP nano ART-PLGA/CS
Nhận xét: KTTP tăng khi tăng pH dung dịch CS. Khi pH dung dịch CS thấp, tăng t lệ C P G làm tăng TTP. Khi pH dung dịch CS cao thì ảnh hư ng của t lệ C P G đến KTTP xảy ra th o hướng ngược lại. TTP tăng có thể là kết quả của việc tăng hấp phụ C khi tăng pH dung dịch CS và t lệ CS/PLGA. Có thể giải th ch điều này như au polym cation C hấp phụ lên bề mặt tiểu phân nano PLGA chủ yếu do lực hút tĩnh điện với tiểu phân P G mang điện âm. Giá trị pKa
pH dd CS
To=10oC
CS/PLGA KTTP
của acid lactic và oligom poly-lactic acid là 3,1, của acid glycolic và oligom poly- glycolic acid là 3,83 [48]. Do đó, khi phân tán trong môi trường có pH cao hơn giá trị pKa, nhóm carboxyl của PLGA bị ion hóa và tiểu phân mang điện âm. Khi tăng pH dung dịch CS trong khoảng khảo sát, độ điện ly của nhóm carboxyl của P G tăng đáng kể trong khi đó C vẫn duy trì được độ điện ly cao nên lực ion tăng, tăng tương tác tĩnh điện giữa PLGA mang điện âm với C mang điện dương. Kết quả lượng C được hấp phụ lên tiểu phân nano ART-P G tăng. Do đó, TTP nano tăng.
- Ảnh hư ng của pH dung dịch CS và nhiệt độ hấp phụ CS đến PDI của hệ tiểu phân nano ART-PLGA/CS
Hình 3.4. Mặt đáp biểu diễn sự ảnh hư ng của pH dung dịch CS và nhiệt độ hấp phụ CS đến PDI của hệ tiểu phân nano ART-PLGA/CS
Nhận xét: PDI có xu hướng tăng khi tăng nhiệt độ hấp phụ CS và pH dung dịch CS. Có thể khi nhiệt độ tăng làm tăng chuyển động nhiệt của các tiểu phân, tăng khả năng va chạm, kết tụ các tiểu phân nên vừa làm tăng TTP trung bình, vừa tạo ra sự phân bố không đồng đều. hi tăng pH dung dịch CS, lượng C được hấp phụ tăng nên làm tăng TTP trung bình nhưng có thể do lượng CS hấp phụ lên các tiểu phân nano ART-PLGA có sẵn không giống nhau, các chuỗi C có độ dài và cấu trúc không gian khác nhau dẫn tới tạo thành các tiểu phân nano ART-PLGA/CS có kích thước khác nhau. Do đó, PDI tăng. Nghiên cứu của Guo C. và Gemeinhart R. A.
pH dd CS
CS/PLGA=0,47
To PDI
(2008) cho thấy CS tạo cấu trúc đa lớp ngoài tiểu phân nano PLGA với nhiều hình dạng khác nhau (hình 3.5). Điều đó góp phần giải thích kết quả thực nghiệm.
Hình 3.5. Sơ đồ biểu diễn hình dạng chuỗi hấp phụ CS trên bề mặt tiểu phân nano
PLGA (A. Chuỗi có phân đoạn hấp phụ, vòng và đuôi tự do; B. Chuỗi liên kết có 1 điểm gắn; C. Cuộn hoặc khối hấp phụ; D. Chuỗi tương tác) [26]
- Ảnh hư ng của t lệ CS/PLGA và pH dung dịch C đến thế zeta của tiểu phân nano trong môi trường nước cất
Hình 3.6. Mặt đáp biểu diễn sự ảnh hư ng của tỷ lệ CS/PLGA và pH dung dịch CS đến thế zeta của tiểu phân nano trong môi trường nước cất
Nhận xét: Thế ta tăng khi tăng t lệ CS/PLGA và giảm pH dung dịch CS. Khi pH dung dịch CS thấp, tăng t lệ CS/PLGA làm thế ta tăng. hi pH dung dịch CS cao, xu hướng ảnh hư ng này không rõ ràng, thậm chí bị đảo ngược. Nguyên nhân có thể do khi tăng t lệ CS/PLGA, lượng C hấp phụ lên tiểu phân nano P G tăng. Các NC cho thấy quá trình hấp phụ CS lên tiểu phân nano PLGA là một quá trình phức tạp với nhiều tương tác xảy ra. Khi t lệ CS/PLGA thấp, lực hút tĩnh điện giữa CS mang điện dương và P G mang điện âm hình thành lớp hấp phụ đơn phân tử đầu tiên. Trong giai đoạn này, mật độ CS trên bề mặt tiểu phân nano P G tăng khi tăng t lệ CS/PLGA, tạo thành nhiều nhóm NH2 tự do trên bề mặt, các nhóm NH2 khi
To=10oC
pH dd CS CS/PLGA
ion hóa thành NH3+ mang điện dương, do đó thế ta tăng. Tuy nhiên sau quá trình hình thành lớp hấp phụ đầu tiên, liên kết hydro và/hoặc lực hút Van der Waal lại là động lực chi phối tạo nên các lớp hấp phụ tiếp theo. Các lớp CS ngoài lớp hấp phụ đầu tiên s không làm tăng thế ta do điện thế bề mặt trên một đơn vị diện tích hiển nhiên không đổi, nhưng lại làm tăng TTP [26], [52].
- Ảnh hư ng của nhiệt độ và pH dung dịch C đến hiệu suất mang thuốc của tiểu phân nano ART-PLGA/CS
Hình 3.7. Mặt đáp biểu diễn sự ảnh hư ng của nhiệt độ và pH dung dịch CS đến hiệu suất mang thuốc của tiểu phân nano ART-PLGA/CS
Nhận xét: Hiệu suất mang thuốc giảm khi tăng pH dung dịch CS, xu hướng này không bị ảnh hư ng b i nhiệt độ giai đoạn hấp phụ CS. Điều này phù hợp với kết quả phân tích bằng phần mềm FormRules mục 3.3.3.2.a và phụ lục 3 và những kết quả khảo át ơ bộ mục 3.3.1.2. Đặc biệt có sự giảm mạnh giá trị EE khi pH dung dịch CS lớn hơn 4,6 (tương đương với giá trị pKa của ART [7]). Kết quả định lượng hàm lượng dược chất toàn phần trong các mẫu sau khi bào chế được trình bày phụ lục 2.2 cho thấy lượng DC hao hụt không nhiều (có thể do thời gian bào chế nhanh, phần lớn DC được bảo vệ trong cấu trúc polyme) nên việc giảm hiệu suất mang thuốc có thể được giải th ch như au: khi tiểu phân nano ART-PLGA phân tán trong dung dịch CS, sự khuếch tán phân tử th o 2 hướng có thể xảy ra, CS vào trong tiểu phân PLGA và ART ra khỏi tiểu phân PLGA. Giá trị pKa của ART xấp xỉ 4,6 cho thấy ART có tính acid yếu, th o đó sự khuếch tán phân tử ART qua cốt polyme PLGA phụ thuộc mạnh vào pH môi trường phân tán, ART khuếch tán ra khỏi tiểu
To pH dd CS
CS/PLGA=0,47 EE
phân nano PLGA nhiều hơn trong môi trường có pH cao hơn, do đó làm giảm hiệu suất mang thuốc.
3.3.3.3. Lựa chọn công thức và thông số quy trình tối ưu
Qua kết quả xử lý của phần mềm InForm v3.1 thu được công thức tối ưu như sau:
- T lệ CS/PLGA: 0,47
- pH dung dịch C 3,12
Tiến hành bào chế công thức tối ưu th o phương pháp mục 2.3.1.b với thời gian hấp phụ CS là 20 phút và thông ố quy trình lựa chọn được từ phần mềm tối ưu hóa là
- Nhiệt độ giai đoạn hấp phụ C 100
C
3.3.3.4. Khảo sát một số đặc tính tiểu phân nano ART-PLGA/CS bào chế theo
công thức và quy trình tối ưu
a. Kết quả đặc tính tiểu phân nano của công thức tối ưu
Đánh giá các đặc tính tiểu phân nano ART-PLGA/CS theo công thức tối ưu bào chế th o phương pháp mục 2.3.1.b. Kết quả được trình bày bảng 3.8.
Bảng 3.8. Kết quả xác định một số đặc tính tiểu phân nano ART-PLGA/CS
theo công thức tối ưu và dự đoán
Chỉ tiêu Dự đ án Công th c tối ư
ch thước tiểu phân (nm) 190,4 191,2
Chỉ số đa phân tán 0,250 0,207
Thế zeta (mV) 35,8 36,6
Hiệu suất mang thuốc (%) 75,00 78,24