- Máy đo thế Z ta và xác định phân bố KTTP Zetasizer NanoZS90 Malvern (Anh) - Máy khuấy từ Ika abort chnik (Đức)
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao himad u (Nhận Bản)
- Máy ly tâm lạnh HERMLE Larbotechnik GmbH – Z326k (Đức) - Máy siêu âm cầm tay Vibra Cell, Sonics & Materials, INC (Mỹ) - Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM H7600, Hitachi, Tokyo (Japan) - Máy lọc nước PURELAB classic UV, ELGA (Anh)
- Máy đo pH Eut ch in trum nt pH 510
- Cân kỹ thuật, cân phân tích, các dụng cụ thu tinh khác - Màng thẩm tích 10000Da
- Ống ly tâm chứa màng iêu lọc 10000Da, Millipore, Billerica, MA (USA) - Tủ lạnh sâu Unicryo (Mỹ), bể siêu âm WUC- A06H, Daihan (Hàn Quốc) - Máy lắc điều nhiệt Shaker Incubator, LSI-100B (Nhật Bản)
- Máy lắc Vortex Mixter VM300 (Đức)
2.2. Nội dung nghiên c u
- Nghiên cứu ảnh hư ng của một số yếu tố như t lệ CS/PLGA, pH dung dịch CS, thời gian, nhiệt độ hấp phụ CS tới đặc tính tiểu phân nano ART-PLGA/CS.
- Sử dụng thuật toán để thiết kế thí nghiệm, phân tích sự ảnh hư ng của các thành phần trong công thức và một số thông số quy trình, lựa chọn công thức tối ưu. - Đánh giá một số đặc tính của hệ tiểu phân nano bào chế được từ công thức tối ưu.
2.3. Phương há nghi n u
2.3.1. Phương pháp bào chế
Qua tham khảo tài liệu [41], tiến hành bào chế tiểu phân nano ART-PLGA/CS th o phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi từ nhũ tương dầu nước. Một số thông số được cố định như au pha dầu (5 ml dung dịch DCM chứa ART 0,4% và PLGA 1%), nồng độ Tw n 80 trong pha nước là 1,5%. Cố định các điều kiện: tốc độ phối hợp pha dầu vào pha nước là 2,5 ml/phút, điều kiện siêu âm (tần số 20000Hz, cường độ 20% công suất tối đa (100W), thời gian siêu âm 5 phút), thời gian bốc hơi loại dung môi hữu cơ là 4 giờ.
C được phối hợp vào pha nước trước khi nhũ hóa (phương pháp 1 hoặc được phối hợp au giai đoạn bốc hơi dung môi (phương pháp 2 . Cụ thể như sau:
a. Phương pháp 1 Phối hợp C vào pha nước trước khi nhũ hóa - Chuẩn bị pha dầu: Hòa tan ART và PLGA vào DCM.
- Chuẩn bị pha nước: Hòa tan C trong 50 ml dung dịch acid ac tic 1% (tt tt , iêu âm cho tan hết. Hòa tan Tw n 80 vào dung dịch C đến nồng độ 1,5%.
- Giai đoạn nhũ hóa Nhỏ pha dầu vào pha nước. Nhũ tương dầu nước được đồng nhất sử dụng đầu siêu âm (Sonics & Materials, INC, Mỹ). Trong quá trình đồng nhất duy trì nhiệt độ 5-10oC bằng nước đá kết hợp khuấy từ.
- Bốc hơi dung môi Nhũ tương thu được tiếp tục được khuấy từ nhẹ nhàng nhiệt độ phòng để loại dung môi hữu cơ.
- Tinh chế và thu hồi sản phẩm: hỗn dịch nano thu được được ly tâm ử dụng ống ly tâm có màng iêu lọc (10000Da 5000 vòng phút trong 30 phút, 10oC. Phần cắn thu được được rửa 2 lần với nước cất, mỗi lần 2 ml, au đó được phân tán vào khoảng 10 ml nước sử dụng bể siêu âm.
ơ đồ quy trình bào chế được tóm tắt hình 2.1.
b. Phương pháp 2 Phối hợp CS au giai đoạn bốc hơi dung môi
- Chuẩn bị pha dầu và pha nước Tương tự phương pháp 1 nhưng thay pha nước là 50 ml dung dịch Tw n 80 1,5% trong nước cất.
- Chuẩn bị dung dịch C Hòa tan C (lượng CS thay đổi) trong 50 ml dung dịch acid acetic 1% (tt/tt), siêu âm cho tan hết, điều chỉnh pH=3,0, 4,0, hoặc 5,0 bằng dung dịch NaOH 3N.
- Giai đoạn nhũ hóa và bốc hơi dung môi Giống phương pháp 1.
- Giai đoạn hấp phụ CS: Phối hợp dung dịch CS vào hỗn dịch nano thu được, khuấy từ (400 vòng phút trong điều kiện nhiệt độ và thời gian khảo sát.
- Tinh chế và thu hồi ản phẩm Giống phương pháp 1. ơ đồ quy trình bào chế được tóm tắt hình 2.2.
Một số mẫu tiểu phân nano ART chỉ sử dụng PLGA (ART-P G được bào chế th o quy trình như mục 2.3.1.b nhưng không có giai đoạn hấp phụ CS.
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano ART-PLGA/CS th o phương pháp 1
Nhỏ giọt
TIỂU PHÂN NANO ART-PLGA/CS
Khuấy từ liên tục 4 giờ
Ly tâm, rửa
PH NƯỚC
(Dung dịch CS+Tween 80/acid acetic)
PHA DẦU
(ART, PLGA, DCM)
HỆ DỊ THỂ
(Tiểu phân nano ART-PLGA/CS, ART tự do, Tween 80, CS tồn dư) Siêu âm, làm lạnh
NHŨ TƯƠNG
Hình 2.2. Sơ đồ qu trình bào chế tiểu phân nano ART-PLGA/CS th o phương pháp
TIỂU PHÂN NANO ART-PLGA/CS
Khuấy từ liên tục 4 giờ
Ly tâm, rửa
PH NƯỚC
(Dung dịch Tween 80 nước)
PHA DẦU
(ART, PLGA, DCM)
HỆ DỊ THỂ
(Tiểu phân nano ART-PLGA, ART tự do, Tween 80 tồn dư)
DUNG DỊCH CS
Nhỏ giọt Siêu âm, làm lạnh
NHŨ TƯƠNG
HỆ DỊ THỂ
(Tiểu phân nano ART-PLGA/CS, ART tự do, Tween 80, CS tồn dư Phối hợp
2.3.2. Các phương pháp đánh giá
2.3.2.1. Phương pháp định ư ng artesunat
Artesunat trong các mẫu thử được định lượng bằng phương pháp HP C [41].
Cá điều kiện sắc ký:
- Pha động: ACN – đệm phosphat pH 3,0 (55:45, tt/tt) (hòa tan 1,36g KH2PO4 vào 1000 ml nước cất, điều chỉnh tới pH 3,0 bằng acid pho phoric đặc). Lọc đệm qua màng lọc k ch thước lỗ lọc 0,45 µm.
- Cột C18 Inertsil ODS (150× 4,6 mm, 0,5 µm, GL Sciences Inc., Nhật Bản). - Thể tích tiêm mẫu 50 µl.
- Tốc độ dòng 1 ml/phút.
- D t ctor V, bước sóng 216 nm.
- Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 20 mg nguyên liệu T, cho vào bình định mức 100 ml. Thêm khoảng 10 ml ACN, lắc cho tan hết. Bổ sung ACN vừa đủ thể tích, lắc đều. Từ dung dịch trên pha loãng thành các dung dịch chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng 20 đến 100 µg/ml, lọc dung dịch chuẩn qua màng lọc k ch thước lỗ lọc 0,45 µm.
- ác định nồng độ ART trong mẫu thử: 1 ml dung dịch T đã được pha loãng đến nồng độ thích hợp bằng CN, lọc qua màng lọc k ch thước lỗ lọc 0,45 µm. Tiêm sắc ký mẫu thử và mẫu chuẩn.
- Nồng độ ART trong mẫu thử tính theo công thức:
Trong đó
Ct, Cc là nồng độ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn (µg/ml) St, c là diện t ch pic của mẫu thử và mẫu chuẩn (mAu)
D là hệ ố pha loãng của mẫu thử
2.3.2.2. Các phương pháp đánh giá đặc tính tiểu phân nano artesunat
a. Đánh giá k ch thước và phân bố k ch thước tiểu phân
Nguyên tắc xác định TTP TTP đựợc xác định bằng phương pháp tán xạ laser. Chiếu 1 chùm tia laser vào hệ, ánh sáng tán xạ từ tiểu phân được hứng lên 1
màn chắn. Phân tích sự dao động của cường độ ánh sáng tán xạ ta có thể đánh giá được chuyển động Brown và đánh giá k ch thước hạt nhờ phương trình tockes - Einstein.
Tiến hành: tiểu phân nano sau ly tâm và rửa 2 lần bằng nước cất được phân tán vào một lượng nước cất vừa đủ (10 ml) sao cho tốc độ đếm (count rate) nằm trong khoảng 200-400 kcps. Tiến hành đo mẫu trên máy Zetasizer, sử dụng cuvet nhựa. b. Đánh giá thế zeta của tiểu phân nano
Nguyên tắc xác định thế ta hi đặt 1 điện trường lên hệ, tiểu phân s di chuyển về ph a điện cực trái dấu với vận tốc t lệ với thế zeta. Tốc độ này được xác định dựa vào việc phân tích chuyển động của tiểu phân thông qua ánh sáng tán xạ. Thế ta được xác định dựa vào độ nhớt môi trường và định luật Smoluchowski - Huckel.
Tiến hành tương tự như phương pháp xác định k ch thước tiểu phân với cuvet nhựa có 2 lá điện cực bằng đồng.
Trường hợp đo thế ta trong các môi trường có pH khác nhau tiểu phân nano sau ly tâm và rửa 2 lần bằng nước cất được phân tán vào một lượng môi trường đệm pho phat các pH khác nhau (khoảng 10 ml) sao cho tốc độ đếm nằm trong khoảng 200-400 kcps.
c. Đánh giá hình thái và k ch thước hệ nano bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM – Transmission Electron Microscope)
Nguyên tắc: một chùm electron hội tụ có năng lượng cao được truyền đến mẫu có bề dày siêu mỏng. Tương tác giữa các điện tử và mẫu có 2 kiểu là đàn hồi và không đàn hồi. Trong tương tác đàn hồi, điện tử không bị mất năng lượng. Trong tương tác không đàn hồi, điện tử mất một phần năng lượng và tạo ra nhiều tín hiệu như điện tử thứ cấp, điện tử Auger, tia X, tia khả kiến. Các electron truyền được qua mẫu cũng xuất hiện cùng lúc này. Do sự giảm năng lượng của electron phụ thuộc chủ yếu vào mật độ và độ dày của mẫu nên các điện tử truyền qua này tạo nên ảnh hai chiều của mẫu phân tích.
Tiến hành: Pha loãng hỗn dịch đặc chứa tiểu phân nano polyme 100 lần, nhỏ trên lưới đồng. Để khô bề mặt lưới đồng nhiệt độ phòng. au đó quan át mẫu bằng kính hiển vi điện tử truyền qua.
d. Phương pháp xác định hiệu suất mang thuốc trong tiểu phân nano - Hàm lượng dược chất tự do trong mẫu nano được xác định như au
Lấy 2 ml hỗn dịch nano thu được au giai đoạn hấp phụ CS cho vào ống ly tâm có màng siêu lọc 10000Da (MWCO 10000Da, Millipore, USA). Ly tâm 5000 vòng/phút trong 30 phút, nhiệt độ 100C. ác định nồng độ ART tự do trong phần dịch trong dưới màng lọc th o phương pháp HP C tại mục 2.3.2.1.
- Hàm lượng dược chất toàn phần (dược chất bao gói và dược chất tự do) trong mẫu nano được xác định như au
Hút chính xác 1 ml hỗn dịch nano thu được au giai đoạn hấp phụ CS cho vào bình định mức 5 ml. Thêm 3 ml ACN, lắc kỹ, đậy kín và siêu âm trong 15 phút. Bổ sung ACN vừa đủ đến vạch, lắc đều. Nồng độ ART toàn phần trong mẫu được xác định theo các bước ghi tại mục 2.3.2.1.
- Công thức t nh hiệu uất mang thuốc
Trong đó
EE: Hiệu suất mang thuốc (%)
Ctp: Nồng độ ART toàn phần trong hỗn dịch nano (µg/ml) Ctd: Nồng độ ART tự do trong hỗn dịch nano (µg/ml)
e. Phương pháp đánh giá giải phóng in vitro của tiểu phân nano polyme ART Qua tham khảo NC bào chế tiểu phân nano ART-PLGA của Nguyen H. T. và cộng sự [41], NC của Yang R. và cộng sự [57], tiến hành đánh giá quá trình giải phóng in vitro của ART từ hệ nano bằng cách sử dụng túi thẩm t ch (k ch thước
màng 10000Da – Membrane Cel, Chicago, IL, USA). Các điều kiện và các bước tiến hành cụ thể như au
- Thiết bị: Máy lắc điều nhiệt (Shaker Incubator, LSI-100B, Nhật Bản)
- Tốc độ lắc: 100 vòng/phút
EE (%) 𝐶𝑡𝑝−𝐶𝑡𝑑
- Môi trường giải phóng: 10 ml môi trường đệm phosphat pH 7,4
- Nhiệt độ môi trường giải phóng 37 ± 0,5oC
- Lấy mẫu vào các thời điểm 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 5 giờ, 7 giờ, 9 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Hút chính xác 1 ml môi trường thử bằng pipet, bổ sung 1 ml môi trường mới.
- Mẫu thử chứa tiểu phân nano: Cắn sau mỗi quá trình ly tâm - rửa được phân tán lại vào trong một lượng nhỏ nước cất bằng cách iêu âm, au đó gộp lại để thu được khoảng 10 ml hỗn dịch đặc chứa khoảng 12 mg ART (đối với hỗn dịch ART-PLGA/CS) hoặc 13 ml hỗn dịch đặc chứa khoảng 16 mg T (đối với hỗn dịch ART-PLGA). Lắc đều hỗn dịch nói trên bằng máy lắc xoáy trong 3 phút, hút chính xác 3 ml hỗn dịch đặc nói trên cho vào túi thẩm tích. Kẹp chặt 2 đầu túi, đặt túi thẩm t ch vào ống ly tâm có thể tích 50 ml chứa 10 ml môi trường đệm pho phat pH ,4 ao cho túi thẩm t ch ngập trong đệm.
- Do hiệu suất ly tâm khác nhau giữa các lần, nồng độ ART trong hỗn dịch đặc được xác định lại bằng cách: lắc đều hỗn dịch đặc trong 3 phút bằng máy lắc xoáy, au đó hút ch nh xác 1 ml hỗn dịch đặc vào bình định mức 5 ml. Thêm 3 ml ACN, lắc đều, đậy kín và siêu âm trong 15 phút. Bổ sung ACN vừa đủ đến vạch, lắc đều, pha loãng dung dịch thử đến nồng độ thích hợp bằng CN. Nồng độ ART trong hỗn dịch đặc được xác định theo các bước ghi tại mục 2.3.2.1.
- Mẫu chuẩn: chuẩn bị như mục 2.3.2.1.
- Cách tính kết quả:
Nồng độ ART thời điểm t được tính theo công thức ghi tại mục 2.3.2.1.
- Khối lượng T đã giải phóng ra môi trường tại thời điểm t được tính bằng công thức:
∑
−
Trong đó
mt là khối lượng T đã giải phóng ra môi trường hoà tan tại thời điểm t Ct là nồng độ T trong môi trường thử tại thời điểm t.
Ci là nồng độ T trong môi trường thử tại thời điểm i
Phần trăm giải phóng tích luỹ tại thời điểm tđược xác định bằng công thức: % ART giải phóng tại thời điểm t =
x 100
Trong đó mt là khối lượng dược chất đã giải phóng tại thời điểm t
mo là khối lượng dược chất ban đầu đưa vào trong túi thẩm tích
f. Phương pháp đánh giá độ ổn định TTP của hỗn dịch nano trong các điều kiện ly tâm khác nhau
Quá trình ly tâm ảnh hư ng nhiều đến các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano, đặc biệt là KTTP. Vì vậy, việc đánh giá lại đặc tính này sau quá trình ly tâm cần được thực hiện. Trong quá trình bào chế hỗn dịch chứa tiểu phân nano ART- PLGA/C , quá trình ly tâm được tiến hành bao gồm việc sử dụng ống ly tâm có hoặc không sử dụng màng siêu lọc 10000Da.
Cách tiến hành:
- Hỗn dịch chứa tiểu phân nano ART-PLGA/CS được đưa vào các ống ly tâm. - Tiến hành ly tâm với tốc độ 8000 vòng/phút trong 20, 30 và 60 phút, 10000 và
12000 vòng/phút trong 20 phút (không sử dụng màng siêu lọc) và 5000 vòng/phút trong 30 phút (có sử dụng màng siêu lọc), nhiệt độ ly tâm 10oC.
- Lấy phần dịch trong và tiến hành đo TTP theo mục 2.3.2.2.a.
- Phân tán lại phần cắn vào 1 thể tích nhỏ nước cất bằng cách siêu âm (sử dụng bể siêu âm WUC- A06H, Daihan, Hàn Quốc), au đó tiến hành đánh giá cảm quan hỗn dịch khi phân tán lại và đo KTTP theo mục 2.3.2.2.a.
Tiêu ch đánh giá mức độ hiệu quả của quá trình ly tâm là sự ổn định về KTTP và khả năng cho hiệu suất thu hồi sản phẩm cao.
g. Phương pháp đánh giá độ ổn định KTTP của hỗn dịch nano trong điều kiện khắc nghiệt
Độ ổn định về KTTP của hệ nano ART-P G C trong điều kiện khắc nghiệt của thử nghiệm đông đá - rã đông (freeze - thaw được tiến hành như au Hỗn dịch đặc chứa tiểu phân nano sau quá trình ly tâm - rửa được tiến hành đông đá hoàn toàn -40oC trong 48 giờ, au đó để rã đông hoàn toàn 25oC. Một số mẫu chúng
tôi tiến hành phối hợp chất bảo vệ (d xtro khan, D (+) trehalose dihydrat, sucrose, manitol) vào 10 ml hỗn dịch đặc chứa tiểu phân nano, nồng độ chất bảo vệ trong hỗn dịch mức 5%. au đó các mẫu cũng được tiến hành đông đá và rã đông trong điều kiện như trên. ự thay đổi TTP nano trước và sau thử nghiệm được thể hiện bằng t ố f/Si trong đó f là TTP au thử nghiệm, i là TTP trước khi thử nghiệm.
2.3.3. Phương pháp thiết kế thí nghiệm và tối ưu hóa công thức
2.3.3.1. Bố trí thí nghiệm
Sử dụng phần mềm MODDE 8.0 ( m tric Inc, để thiết kế thí nghiệm ngẫu nhiên dựa trên nguyên tắc hợp tử tại tâm.
2.3.3.2. Phân tích và tối ưu h a
ác định các yếu tố ảnh hư ng và lựa chọn công thức bào chế tối ưu bằng phần mềm FormRules v2.0 và InForm v3.1 (Intelligensys Ltd, UK) dựa trên mô hình mạng neuron nhân tạo.
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết q ả x y dựng đường h ẩn iể thị mối tương quan giữa diện tí h pic và nồng độ artes nat
Pha dãy dung dịch chuẩn ART có nồng độ trong khoảng 20-100 µg/ml và tiến hành chạy HP C th o các điều kiện đã nêu mục 2.3.2.1. Xây dựng mối tương