2.3.2.1. Phương pháp định ư ng artesunat
Artesunat trong các mẫu thử được định lượng bằng phương pháp HP C [41].
Cá điều kiện sắc ký:
- Pha động: ACN – đệm phosphat pH 3,0 (55:45, tt/tt) (hòa tan 1,36g KH2PO4 vào 1000 ml nước cất, điều chỉnh tới pH 3,0 bằng acid pho phoric đặc). Lọc đệm qua màng lọc k ch thước lỗ lọc 0,45 µm.
- Cột C18 Inertsil ODS (150× 4,6 mm, 0,5 µm, GL Sciences Inc., Nhật Bản). - Thể tích tiêm mẫu 50 µl.
- Tốc độ dòng 1 ml/phút.
- D t ctor V, bước sóng 216 nm.
- Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 20 mg nguyên liệu T, cho vào bình định mức 100 ml. Thêm khoảng 10 ml ACN, lắc cho tan hết. Bổ sung ACN vừa đủ thể tích, lắc đều. Từ dung dịch trên pha loãng thành các dung dịch chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng 20 đến 100 µg/ml, lọc dung dịch chuẩn qua màng lọc k ch thước lỗ lọc 0,45 µm.
- ác định nồng độ ART trong mẫu thử: 1 ml dung dịch T đã được pha loãng đến nồng độ thích hợp bằng CN, lọc qua màng lọc k ch thước lỗ lọc 0,45 µm. Tiêm sắc ký mẫu thử và mẫu chuẩn.
- Nồng độ ART trong mẫu thử tính theo công thức:
Trong đó
Ct, Cc là nồng độ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn (µg/ml) St, c là diện t ch pic của mẫu thử và mẫu chuẩn (mAu)
D là hệ ố pha loãng của mẫu thử
2.3.2.2. Các phương pháp đánh giá đặc tính tiểu phân nano artesunat
a. Đánh giá k ch thước và phân bố k ch thước tiểu phân
Nguyên tắc xác định TTP TTP đựợc xác định bằng phương pháp tán xạ laser. Chiếu 1 chùm tia laser vào hệ, ánh sáng tán xạ từ tiểu phân được hứng lên 1
màn chắn. Phân tích sự dao động của cường độ ánh sáng tán xạ ta có thể đánh giá được chuyển động Brown và đánh giá k ch thước hạt nhờ phương trình tockes - Einstein.
Tiến hành: tiểu phân nano sau ly tâm và rửa 2 lần bằng nước cất được phân tán vào một lượng nước cất vừa đủ (10 ml) sao cho tốc độ đếm (count rate) nằm trong khoảng 200-400 kcps. Tiến hành đo mẫu trên máy Zetasizer, sử dụng cuvet nhựa. b. Đánh giá thế zeta của tiểu phân nano
Nguyên tắc xác định thế ta hi đặt 1 điện trường lên hệ, tiểu phân s di chuyển về ph a điện cực trái dấu với vận tốc t lệ với thế zeta. Tốc độ này được xác định dựa vào việc phân tích chuyển động của tiểu phân thông qua ánh sáng tán xạ. Thế ta được xác định dựa vào độ nhớt môi trường và định luật Smoluchowski - Huckel.
Tiến hành tương tự như phương pháp xác định k ch thước tiểu phân với cuvet nhựa có 2 lá điện cực bằng đồng.
Trường hợp đo thế ta trong các môi trường có pH khác nhau tiểu phân nano sau ly tâm và rửa 2 lần bằng nước cất được phân tán vào một lượng môi trường đệm pho phat các pH khác nhau (khoảng 10 ml) sao cho tốc độ đếm nằm trong khoảng 200-400 kcps.
c. Đánh giá hình thái và k ch thước hệ nano bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM – Transmission Electron Microscope)
Nguyên tắc: một chùm electron hội tụ có năng lượng cao được truyền đến mẫu có bề dày siêu mỏng. Tương tác giữa các điện tử và mẫu có 2 kiểu là đàn hồi và không đàn hồi. Trong tương tác đàn hồi, điện tử không bị mất năng lượng. Trong tương tác không đàn hồi, điện tử mất một phần năng lượng và tạo ra nhiều tín hiệu như điện tử thứ cấp, điện tử Auger, tia X, tia khả kiến. Các electron truyền được qua mẫu cũng xuất hiện cùng lúc này. Do sự giảm năng lượng của electron phụ thuộc chủ yếu vào mật độ và độ dày của mẫu nên các điện tử truyền qua này tạo nên ảnh hai chiều của mẫu phân tích.
Tiến hành: Pha loãng hỗn dịch đặc chứa tiểu phân nano polyme 100 lần, nhỏ trên lưới đồng. Để khô bề mặt lưới đồng nhiệt độ phòng. au đó quan át mẫu bằng kính hiển vi điện tử truyền qua.
d. Phương pháp xác định hiệu suất mang thuốc trong tiểu phân nano - Hàm lượng dược chất tự do trong mẫu nano được xác định như au
Lấy 2 ml hỗn dịch nano thu được au giai đoạn hấp phụ CS cho vào ống ly tâm có màng siêu lọc 10000Da (MWCO 10000Da, Millipore, USA). Ly tâm 5000 vòng/phút trong 30 phút, nhiệt độ 100C. ác định nồng độ ART tự do trong phần dịch trong dưới màng lọc th o phương pháp HP C tại mục 2.3.2.1.
- Hàm lượng dược chất toàn phần (dược chất bao gói và dược chất tự do) trong mẫu nano được xác định như au
Hút chính xác 1 ml hỗn dịch nano thu được au giai đoạn hấp phụ CS cho vào bình định mức 5 ml. Thêm 3 ml ACN, lắc kỹ, đậy kín và siêu âm trong 15 phút. Bổ sung ACN vừa đủ đến vạch, lắc đều. Nồng độ ART toàn phần trong mẫu được xác định theo các bước ghi tại mục 2.3.2.1.
- Công thức t nh hiệu uất mang thuốc
Trong đó
EE: Hiệu suất mang thuốc (%)
Ctp: Nồng độ ART toàn phần trong hỗn dịch nano (µg/ml) Ctd: Nồng độ ART tự do trong hỗn dịch nano (µg/ml)
e. Phương pháp đánh giá giải phóng in vitro của tiểu phân nano polyme ART Qua tham khảo NC bào chế tiểu phân nano ART-PLGA của Nguyen H. T. và cộng sự [41], NC của Yang R. và cộng sự [57], tiến hành đánh giá quá trình giải phóng in vitro của ART từ hệ nano bằng cách sử dụng túi thẩm t ch (k ch thước
màng 10000Da – Membrane Cel, Chicago, IL, USA). Các điều kiện và các bước tiến hành cụ thể như au
- Thiết bị: Máy lắc điều nhiệt (Shaker Incubator, LSI-100B, Nhật Bản)
- Tốc độ lắc: 100 vòng/phút
EE (%) 𝐶𝑡𝑝−𝐶𝑡𝑑
- Môi trường giải phóng: 10 ml môi trường đệm phosphat pH 7,4
- Nhiệt độ môi trường giải phóng 37 ± 0,5oC
- Lấy mẫu vào các thời điểm 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 5 giờ, 7 giờ, 9 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Hút chính xác 1 ml môi trường thử bằng pipet, bổ sung 1 ml môi trường mới.
- Mẫu thử chứa tiểu phân nano: Cắn sau mỗi quá trình ly tâm - rửa được phân tán lại vào trong một lượng nhỏ nước cất bằng cách iêu âm, au đó gộp lại để thu được khoảng 10 ml hỗn dịch đặc chứa khoảng 12 mg ART (đối với hỗn dịch ART-PLGA/CS) hoặc 13 ml hỗn dịch đặc chứa khoảng 16 mg T (đối với hỗn dịch ART-PLGA). Lắc đều hỗn dịch nói trên bằng máy lắc xoáy trong 3 phút, hút chính xác 3 ml hỗn dịch đặc nói trên cho vào túi thẩm tích. Kẹp chặt 2 đầu túi, đặt túi thẩm t ch vào ống ly tâm có thể tích 50 ml chứa 10 ml môi trường đệm pho phat pH ,4 ao cho túi thẩm t ch ngập trong đệm.
- Do hiệu suất ly tâm khác nhau giữa các lần, nồng độ ART trong hỗn dịch đặc được xác định lại bằng cách: lắc đều hỗn dịch đặc trong 3 phút bằng máy lắc xoáy, au đó hút ch nh xác 1 ml hỗn dịch đặc vào bình định mức 5 ml. Thêm 3 ml ACN, lắc đều, đậy kín và siêu âm trong 15 phút. Bổ sung ACN vừa đủ đến vạch, lắc đều, pha loãng dung dịch thử đến nồng độ thích hợp bằng CN. Nồng độ ART trong hỗn dịch đặc được xác định theo các bước ghi tại mục 2.3.2.1.
- Mẫu chuẩn: chuẩn bị như mục 2.3.2.1.
- Cách tính kết quả:
Nồng độ ART thời điểm t được tính theo công thức ghi tại mục 2.3.2.1.
- Khối lượng T đã giải phóng ra môi trường tại thời điểm t được tính bằng công thức:
∑
−
Trong đó
mt là khối lượng T đã giải phóng ra môi trường hoà tan tại thời điểm t Ct là nồng độ T trong môi trường thử tại thời điểm t.
Ci là nồng độ T trong môi trường thử tại thời điểm i
Phần trăm giải phóng tích luỹ tại thời điểm tđược xác định bằng công thức: % ART giải phóng tại thời điểm t =
x 100
Trong đó mt là khối lượng dược chất đã giải phóng tại thời điểm t
mo là khối lượng dược chất ban đầu đưa vào trong túi thẩm tích
f. Phương pháp đánh giá độ ổn định TTP của hỗn dịch nano trong các điều kiện ly tâm khác nhau
Quá trình ly tâm ảnh hư ng nhiều đến các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano, đặc biệt là KTTP. Vì vậy, việc đánh giá lại đặc tính này sau quá trình ly tâm cần được thực hiện. Trong quá trình bào chế hỗn dịch chứa tiểu phân nano ART- PLGA/C , quá trình ly tâm được tiến hành bao gồm việc sử dụng ống ly tâm có hoặc không sử dụng màng siêu lọc 10000Da.
Cách tiến hành:
- Hỗn dịch chứa tiểu phân nano ART-PLGA/CS được đưa vào các ống ly tâm. - Tiến hành ly tâm với tốc độ 8000 vòng/phút trong 20, 30 và 60 phút, 10000 và
12000 vòng/phút trong 20 phút (không sử dụng màng siêu lọc) và 5000 vòng/phút trong 30 phút (có sử dụng màng siêu lọc), nhiệt độ ly tâm 10oC.
- Lấy phần dịch trong và tiến hành đo TTP theo mục 2.3.2.2.a.
- Phân tán lại phần cắn vào 1 thể tích nhỏ nước cất bằng cách siêu âm (sử dụng bể siêu âm WUC- A06H, Daihan, Hàn Quốc), au đó tiến hành đánh giá cảm quan hỗn dịch khi phân tán lại và đo KTTP theo mục 2.3.2.2.a.
Tiêu ch đánh giá mức độ hiệu quả của quá trình ly tâm là sự ổn định về KTTP và khả năng cho hiệu suất thu hồi sản phẩm cao.
g. Phương pháp đánh giá độ ổn định KTTP của hỗn dịch nano trong điều kiện khắc nghiệt
Độ ổn định về KTTP của hệ nano ART-P G C trong điều kiện khắc nghiệt của thử nghiệm đông đá - rã đông (freeze - thaw được tiến hành như au Hỗn dịch đặc chứa tiểu phân nano sau quá trình ly tâm - rửa được tiến hành đông đá hoàn toàn -40oC trong 48 giờ, au đó để rã đông hoàn toàn 25oC. Một số mẫu chúng
tôi tiến hành phối hợp chất bảo vệ (d xtro khan, D (+) trehalose dihydrat, sucrose, manitol) vào 10 ml hỗn dịch đặc chứa tiểu phân nano, nồng độ chất bảo vệ trong hỗn dịch mức 5%. au đó các mẫu cũng được tiến hành đông đá và rã đông trong điều kiện như trên. ự thay đổi TTP nano trước và sau thử nghiệm được thể hiện bằng t ố f/Si trong đó f là TTP au thử nghiệm, i là TTP trước khi thử nghiệm.
2.3.3. Phương pháp thiết kế thí nghiệm và tối ưu hóa công thức
2.3.3.1. Bố trí thí nghiệm
Sử dụng phần mềm MODDE 8.0 ( m tric Inc, để thiết kế thí nghiệm ngẫu nhiên dựa trên nguyên tắc hợp tử tại tâm.
2.3.3.2. Phân tích và tối ưu h a
ác định các yếu tố ảnh hư ng và lựa chọn công thức bào chế tối ưu bằng phần mềm FormRules v2.0 và InForm v3.1 (Intelligensys Ltd, UK) dựa trên mô hình mạng neuron nhân tạo.
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết q ả x y dựng đường h ẩn iể thị mối tương quan giữa diện tí h pic và nồng độ artes nat
Pha dãy dung dịch chuẩn ART có nồng độ trong khoảng 20-100 µg/ml và tiến hành chạy HP C th o các điều kiện đã nêu mục 2.3.2.1. Xây dựng mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ ART. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.1 và hình 3.1.
Bảng 3.1. Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ ART Nồng độ thực tế (µg/ml) 22,2 44,4 66,6 88,8 111
Diện tích pic (mAu.s) 16874 31720 49951 66756 81826
Hình 3.1. Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ ART
Kết quả cho thấy: R2 > 0,99, do vậy có mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ artesunat trong khoảng nồng độ nói trên. Do đó, phương pháp HP C được sử dụng để định lượng ART trong các thí nghiệm tiếp theo.
3.2. ết q ả à hế tiể h n nan RT-PLG CS the hương há 1
Tiểu phân nano T-PLGA/CS được bào chế th o phương pháp mục 2.3.1.a, pha nước chứa 20 mg C (t lệ CS/PLGA=0,4). au 4 giờ bốc hơi dung môi, quan át thấy mẫu có nhiều lắng cặn, màu đ n. Đo TTP cho kết quả KTTP=5443,4 nm, PDI=1,000. Giải th ch hiện tượng này có thể do CS dạng ba không tan trong nước
y = 742.98x - 57 R² = 0.9989 0 20000 40000 60000 80000 100000 0 30 60 90 120 Diện tí h i (m .s) Nồng độ RT (µg ml)
nên phải sử dụng acid acetic làm dung môi pha nước, trong khi đó, Tween 80 kém bền trong môi trường acid. Khi tác động lực gây phân tán bằng thiết bị siêu âm trong môi trường acid acetic, một t lệ Tween 80 có thể bị thủy phân làm giảm khả năng nhũ hóa, dẫn đến KTTP lớn [9]. Ngoài ra, PLGA 50:50, KLPT=7-17kDa là loại có thành phần acid lactic thấp và KLPT thấp nên kém bền trong môi trường acid, đặc biệt dạng tự do, có thể bị thủy phân, cắt mạch khi tác động siêu âm [34].
Do đó, nghiên cứu này không lựa chọn phương pháp phối hợp C vào pha nước trước giai đoạn nhũ hóa để bào chế tiểu phân nano ART-PLGA/CS.
3.3. ết q ả à hế tiể h n nan RT-PLG CS the hương há 2
3.3.1. Xác định công thức bào chế cơ bản
Kết quả từ nhiều NC bào chế hệ nano polyme sử dụng kết hợp PLGA và CS cho thấy t lệ CS/PLGA (kl/kl) và pH dung dịch CS là các yếu tố quan trọng quyết định đặc tính tiểu phân nano như T và phân bố KTTP, thế zeta, hiệu suất mang thuốc,….[19], [26], [53]. Do đó, ảnh hư ng của 2 yếu tố này được khảo sát.
3.3.1.1. Lựa chọn tỷ lệ CS/PLGA
Tiến hành bào chế tiểu phân nano ART theo phương pháp mục 2.3.1.b, cố định pH dung dịch CS là 3,0, nhiệt độ giai đoạn hấp phụ CS là 25o
C, thời gian hấp phụ là 30 phút, t lệ CS/PLGA (kl/kl) thay đổi từ 0,2-1,0. Kết quả các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano T được thể hiện trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. nh hư ng của tỷ ệ CS/PLGA đến đặc tính lý hóa tiểu phân nano ART
Tỷ lệ CS/PLGA (kl/kl) KTTP (nm) PDI Thế zeta (mV) EE (%) 0,0 165,0 0,170 -21,0 83,75 0,2 178,5 0,207 27,6 81,11 0,4 194,7 0,212 43,0 76,84 0,6 197,8 0,231 50,8 73,33 0,8 215,6 0,261 51,7 73,94 1,0 219,6 0,276 52,5 70,99 Nhận xét:
Về KTTP, các mẫu có CS đều có KTTP lớn hơn o với mẫu không có CS. hi tăng t lệ CS/PLGA từ 0,2-1,0 thì TTP tăng đáng kể, từ 178,5 nm (t lệ CS/PLGA 0,2 đến
219,6 nm (t lệ CS/PLGA=1,0). TTP có xu hướng tăng có thể do t lệ CS/PLGA tăng làm tăng lượng CS hấp phụ lên bề mặt tiểu phân nano polyme PLGA.
Về chỉ số đa phân tán (PDI , các mẫu có C đều có giá trị PDI > 0,200. PDI tăng khi tăng t lệ CS/PLGA, tuy nhiên tất cả các mẫu đều có PDI < 0,300 cho thấy ự phân bố KTTP khá đồng nhất. Mẫu không có CS có khoảng phân bố k ch thước rất hẹp (PDI=0,170). Sự khác nhau này có thể vì khi tăng lượng C đưa vào làm tăng độ nhớt của hệ, do đó các tiểu phân phân bố không đồng đều.
Về thế zeta, mẫu không có CS có thế zeta âm (-21,0 mV). Các mẫu có C đều có thế ta dương. hi tăng t lệ CS/PLGA, thế ta tăng. Tuy nhiên khi t lệ CS/PLGA 0,6 và cao hơn, thế zeta tăng không nhiều. Có thể dự đoán quá trình hấp phụ C lên tiểu phân nano P G trong điều kiện này (pH 3,0, nhiệt độ 25oC đã đạt trạng thái bão hòa điện tích. Tiểu phân nano ART khi chưa bao C có thế zeta âm là do nhóm carboxylic tận cùng của PLGA [26], [53]. Khi bao CS, thế zeta của tiểu phân nano chuyển ang dương chứng tỏ sự có mặt của CS trên bề mặt tiểu phân [26], [52].
Về hiệu suất mang thuốc (EE), mẫu chưa bao CS cho giá trị EE khá cao (83,75%). Các mẫu có C đều có giá trị EE thấp hơn. Điều này có thể do khi phân tán hỗn dịch nano ART-PLGA vào dung dịch CS làm cho hỗn dịch nano bị pha