a. Thiết kế mô hình đánh giá sinh khả dụng (SKD)
Chuẩn bị động vật thí nghiệm: 6 con thỏ trưởng thành có trọng lượng 2-3 kg được nuôi trong phòng thí nghiệm bộ môn Dược lực Đại học Dược Hà Nội. Cho thỏ nhịn ăn trong vòng 24 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm.
Chuẩn bị mẫu thuốc: hệ TVNH dạng lỏng được phân tán đồng nhất trong môi trường nước. Nguyên liệu rotundin được bào chế dưới dạng hỗn dịch phân tán trong dung dịch NaCMC 0,5%.
- Mô hình đánh giá SKD: 6 con thỏ sẽ được chia là 2 nhóm (mỗi nhóm 3 con).
- Nhóm 1: cho uống dạng nguyên liệu ở mức liều 3mg RTD/con
Nhóm 2: cho uống một lượng chính xác hệ TVNH dạng lỏng đã phân tán trong nước, tương đương 3 mg RTD/con
Lấy mẫu và xử lý huyết tương: tại các thời điểm 5 phút, 15 phút, 30 phút, 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 24 giờsau khi cho thỏ uống, tiến hành hút 2ml máu ở động mạch tai thỏ cho vào ống có tráng heparin. Ly tâm mẫu máu ở tốc độ 6000 rpm trong 10 phút. Thu huyết tương, bảo quản ở nhiệt độ -10ºC trước khi đưa đi phân tích bằng LC-MS/MS
b. Phương pháp chiết QuEChERS
Tham khảo phương pháp chiết QuEChERS trong tài liệu với quy trình như sau[7]: Hút chính xác 0,5ml huyết tương cho vào ống ly tâm 2ml. Thêm 25µl dd berberin (BBR) 50 ng/ml và 0,5ml acetonitril. Tiến hành lắc xoáy trong 1 phút để tạo hỗn hợp đồng nhất. Tiếp tục thêm 0,2g MgSO4 và 0,05 g NaCl. Lắc xoáy trong
1 phút, sau đó ly tâm với tốc độ 13000 rpm trong 10 phút. Hút lớp dịch lỏng phía trên cùng đưa đi định lượng bằng phương pháp LC-MS/MS.
c. Phương pháp đinh lượng rotuntin bằng phương pháp LC-MS/MS
Thẩm định phương pháp định lượng
Sau khi khảo sát phương pháp để lựa chọn điều kiện tiến hành định lượng RTD trong máu thỏ bằng LC-MS/MS (trình bày trong phụ lục 2), tiến hành thẩm định phương pháp định lượng. Quy trình thẩm định phương pháp định lượng được tiến hành theo hướng dẫn của FDA gồm các chỉ tiêu thẩm định sau:tính chọn lọc, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ lặp lại và độ thu hồi.
Phương pháp định lượng rotundin trong huyết tương bằng LC-MS/MS Sử dụng phương pháp thêm nội chuẩn (IS): berberin. Tiến hành phân tích định lượng rotundin trong dịch chiết huyết tương bằng phương pháp LC-MS/MS với các điều kiện và thông số như sau:
- Điều kiện HPLC: Cột sắc ký C18 (150mm × 4,6mm × 5μm), tốc độ dòng: 0,5ml/phút,thể tích tiêm mẫu: 5µl.
- Pha động gồm acetonitril(ACN) và dd amoniaceat 5mM.Sử dụng chương trình gradien nồng độ như sau: từ 0 – 1 phút, tỉ lệ ACN là 50%. Từ 1 – 2 phút, tỉ lệACN tăng dần từ 50 lên 100%. Từ 2-6 phút, tỉ lệ ACN là 100% . Từ 6 - 7,5 phút, tỉ lệ ACN giảm dần từ 100% xuống 50% và từ phút thứ 7,5 trở đi tỉ lệ ACN là 50%.
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1.Kết quả xây dựng phương pháp định lượng rotundin