X- THU NHẬN ENZYM TỪN ỘI TẠNG CÁ: 1-NGUYÊN LI ỆU:
2-1 THUYẾT MINH QUY TRÌNH:
Nội tạng cá tra: nội tạng cá tra được thu từ nhà máy chế biến thủy sản được bảo quản lạnh đơng trước khi đem trích ly để thu nhận enzyme (-20oC). Thời gian bảo quản nội tạng càng ngắn càng tốt để tránh hiện tượng enzyme bị biến tính.
Xử lý: loại bỏ mật ra khỏi nội tạng cá tra.
Xay mẫu: cho nội tạng vào xay ở máy xay thịt. Trong quá trình xay cần giữ lạnh để tránh biến tính enzyme.
Trích ly enzyme: phối trộn nguyên liệu đã xay với dung mơi (nước hoặc dung dịch Na2CO3, HCl). Trong quá trình này enzyme trong nội tạng sẽ hịa tan và khuyếch tán vào dung mơi.
Tự phân: để thu nhận enzyme nội bào.
Lọc để thu dịch chứa enzyme: mục đích loại bỏ tạp chất khơng tan cĩ trong dịch enzyme.
Kết tủa: để tinh sạch enzyme, chúng ta bổ sung các dung mơi hữu cơ (ethanol) với tỷ lệ thích hợp vào dịch enzyme thơ. Khi đĩ kết tủa sẽ xuất hiện trong hỗn hợp. Quá trình kết tủa cần giữ ở nhiệt độ 200C.
Ly tâm thu nhận protein đã kết tủa: hỗn hợp được ly tâm ở 4oC với vận tốc 3500 vịng/phút trong thời gian 10 phút nhằm mục đích thu nhận phần kết tủa.
2-2- Các phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme [3] 2-2-1-Phương pháp trích ly và kết tủa bằng muối
Nguyên tắc: muối cĩ nồng độ cao cĩ tác dụng với phân tử nước bao quanh protein enzyme và làm chuyển hĩa điện tích, làm thay đổi tính hịa tan của enzyme.
Trong cơng nghiệp enzyme, người ta thường sử dụng muối ammonium sulfate. Nhược điểm của nĩ là tính ăn mịn rất cao. Sau này người ta thay thế bằng sodium sulfate, muối này khơng gây hư hỏng thiết bị nhưng tính hịa tan của nĩ khơng tốt.
Nhiệt độ tiến hành kết tủa enzyme cĩ thể là 35 – 400C nhưng để tránh khả năng làm mất hoạt tính enzyme, người ta thường phải làm lạnh dung dịch muối và dung dịch enzyme trước khi trộn hai loại dung dịch này lại với nhau.
Nồng độ tối ưu của muối dùng trong kết tủa enzyme sẽ được xác định trong những thí nghiệm cụ thể. Khoảng tối ưu của nồng độ muối dùng trong kết tủa enzyme rất rộng, khoảng 20-80%.
2-2-2-Phương pháp trích ly và kết tủa enzyme bằng dung mơi hữu cơ
Dung mơi hữu cơ cĩ ảnh hưởng rất lớn đến khả năng hịa tan của enzyme, ảnh hưởng solvat hĩa của phân tử nước xung quanh phân tử enzyme bị thay đổi, tương tác giữa enzyme sẽ tăng lên.
Nguyên tắc: khi cho dung mơi hữu cơ vào dung dịch enzyme sẽ làm giảm khả năng hịa tan của nước bao quanh enzyme. Hiện tượng này xảy ra là do sự giảm hằng số
điện ly của dung mơi, đẩy một lượng lớn nước. Các phân tử nước sắp xếp rất trật tự xung quanh các đoạn kỵ nước trên bề mặt enzyme cĩ thể được thay thế bằng phân tử của dung mơi hữu cơ. Từ đĩ làm gia tăng độ hịa tan của chúng. Các enzyme cĩ tính kỵ nước mạnh sẽ cĩ khả năng hịa tan hồn tồn trong dung mơi hữu cơ.
Nguyên nhân cơ bản của sự quần hợp protein enzyme cĩ thể do các lực tĩnh điện, lực Van der Waals (giống như ở muối). Tương tác kỵ nước trong trường hợp này khơng cĩ ý nghĩa lớn, tại điểm đẳng điện thì sự kết tủa diễn ra tốt nhất, khi đĩ lượng dung mơi sử dụng cho quá trình tủa là ít nhất.
Trong cơng nghiệp sản xuất enzyme, người ta thường sử dụng ethanol và aceton để kết tủa enzyme. Khi tiến hành kết tủa enzyme bằng những dung mơi hữu cơ thì cần hết sức lưu ý đến nhiệt độ. Do enzyme rất nhạy cảm với nhiệt độ khi cĩ mặt của các chất như ethanol hoặc aceton, nên bắt buộc khi tiến hành kết tủa enzyme phải làm lạnh cả dung mơi hữu cơ và dung dịch enzyme. Mức độ nhạy cảm nhiệt độ của enzyme khi cĩ mặt các dung mơi hữu cơ thường mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi cĩ mặt của muối vơ cơ. Người ta thường tiến hành kết tủa enzyme bằng dung mơi hữu cơ ở nhiệt độ từ 3-100C. Tỷ lệ và nồng độ các dung mơi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme được xác định bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme cĩ trong dung dịch.
Nhược điểm: cĩ thể xảy ra hiện tượng biến tính khơng thuận nghịch khi kết tủa bằng dung mơi hữu cơ. Nguyên nhân là do, khi hằng số điện mơi giảm phân tử protein cĩ thể tự tháo gỡ và tạo thành dạng khơng hoạt động, trong khi các gốc kỵ nước lại tiếp xúc với dung mơi. Hiện tượng này xảy ra khi tiến hành tủa ở nhiệt độ phịng, nếu thực hiện ở nhiệt độ 4-10oC khơng thấy xuất hiện kết tinh enzyme.
Trong quá trình kết tủa bằng dung mơi hữu cơ tạo ra 1 nhiệt lượng lớn cĩ thể làm mất hoạt tính của enzyme. Do đĩ dung dịch sau lọc cùng dung mơi được làm lạnh trước khi sử dụng và dung mơi phải được cho từ từ và khuấy liên tục để tránh sự tăng nhiệt độ cục bộ bên trong hỗn hợp ( t = 5-10’, trong lúc đĩ nhiệt độ khơng quá 5oC )
2-2-3-Phương pháp sử dụng pH
Protein là chất lưỡng cực, chúng cĩ cả nhĩm axit và nhĩm bazơ. Mức độ hịa tan của enzyme phụ thuộc vào pH, mức độ này là tối thiểu khi chúng ở điểm đẳng điện, phần lớn protein cĩ điểm đẳng điện ở khoảng axit, vì thế quá trình này được gọi là kết tủa axit. Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện thường được thực hiện ở quy mơ nhỏ, chứ khơng thực hiện ở quy mơ cơng nghiệp. Thời gian tạo điểm đẳng điện và thời gian lưu để tạo kết tủa bền vững thường làm thay đổi hoạt tính enzyme. Như vậy, thiết bị phản ứng càng lớn, khả năng làm thay đổi hoạt tính enzyme càng lớn. Khi đĩ, thời gian khuấy trộn và thời gian lắng kết tủa càng kéo dài, enzyme càng dễ bị biến tính.
2-2-4-Các quy trình thu nhận chế phẩm enzyme
2-2-4-1. Phương pháp tách chiết enzyme với aceton và rửa tủa (2 lần) bằng aceton
Quá trình trích ly thực hiện ở 200C với thời gian là 3h và tỷ lệ nguyên liệu và dung dịch Na2CO3 1.2 % theo khối lượng là 1 : 2.
Quá trình kết tủa sử dụng dung mơi hữu cơ là aceton với tỷ lệ nguyên liệu và dung mơi là 1 : 4, khuấy trong 10 phút để lắng 15 phút ở nhiệt độ lạnh.
Sấy tủa ở 30-350C.
Hình 0.27: Sơđồ thu nhận enzyme bằng phương pháp tách chiết với aceton.
Xử lý nguyên liệu, xay nhỏ Nguyên liệu được bảo quản ở nhiệt độ đơng đá Trích ly Na2CO3 1,2 % Tủa thu lấy enzyme Ly tâm lấy tủa (lần 1) Rửa tủa bằng aceton Ly tâm lấy tủa (lần 2) Sấy tủa Nghiền nhỏ Chế phẩm enzyme Aceton lạnh
2-2-4-2. Phương pháp tách chiết enzyme bằng cồn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các giai đoạn tách chiết với cồn tuyệt đối với những tỷ lệ 1:4, 1:5, 1:7 và cồn 96o tương tự như với aceton nhưng thay aceton bằng cồn.
2-2-4-3. Phương pháp tách chiết enzyme kết tủa bằng (NH4)2SO4
Hình 0.28. Sơđồ tách chiết enzyme bằng phương pháp kết tủa bằng muối (NH4)2SO4
Trích ly lần 1 với nước cất với tỉ lệ nguyên liệu và dung mơi là 1 : 1, để tự phân 6- 8 h ở 200C. Nguyên liệu bảo quản tươi Xử lý, và xay nhỏ Trích ly lần 1 Lọc lấy dung dịch Trích ly lần 2 Lọc lấy dung dịch Kết tủa Ly tâm lấy tủa Sấy tủa Nghiền Chế phẩm enzyme Nước cất H2SO4 0,25N (NH4)2SO4 0,25 N
Trích ly lần 2 với dung dịch H2SO4 0,25 , tỷ lệ nguyên liệu và dung mơi là 2 : 1, pH 3,5-4, trích ly trong 1 h.
Quá trình kết tủa thực hiện với (NH4)2SO4 60-70%, với tỷ lệ nguyên liệu và dungmơi là 1 : 2.
2-2-4-4. Phương pháp thu nhận enzyme thơ bằng phương pháp sấy
Lấy tụy tươi đã được bảo quản, cân trọng lượng và trộn với tinh bột một lượng bằng 10% so với trọng lượng tụy tươi, tiếp theo sấy ở những nhiệt độ 50oC, 60oC, 70oC. Sau 1 thời gian sấy ở những nhiệt độ trên thì ta đem xay nhuyễn và được chế phẩm enzyme thơ.
Trong quá trình ly tâm lấy tủa, trộn với tá dược như lactose, glucose, hay tinh bột là các chất phụ gia cĩ tính chất ổn định enzyme đồng thời rút ngắn thời gian sấy, hạn chế sự giảm hoạt tính enzyme trong khi sấy . Thường sấy ở chân khơng nhiệt độ to
= 45oC.
Sấy khơ : sau khi ly tâm thu phần kết tủa, đem sấy khơ cĩ thổi khí ở nhiệt độ 30 – 40oC hoặc sấy chân khơng hay thiết bị sấy đơng khơ. ðể tránh bị mất hoạt tính người ta trộn thêm vào chế phẩm enzyme các chất độn như tinh bột hồ tan, maltose dextrin trong quá trình sấy.
2-2-5-Phương pháp tách và làm sạch enzyme
Gần đây ứng dụng các phương pháp mới (điện di, sắc ký trao đổi ion, lọc gel…) phối hợp với các biện pháp thường đđược dùng trước đây (biến tính chọn lọc, kết tủa phân đoạn, sắc ký hấp phụ) cho phép thu được phẩm vật của nhiều enzyme với độ thuần khiết cao.
Mặc dù trong việc xây dựng phương pháp mới đã đạt được nhiều kết quả, tuy nhiên vấn đề tách làm thuần khiết enzyme hiện nay vẫn cịn là một cơng tác phức tạp, khĩ khăn. Nguyên nhân chủ yếu do một mặt enzyme cĩ trong tế bào với lượng rất ít, mặc khác nĩ luơn cĩ đồng thời với các protein khác cũng cĩ các tính chất lý hố rất giống nhau, hơn nữa enzyme lại rất khơng bền, dễ bị mất khả năng xúc tác do tác động của các yếu tố bên ngồi.
Trong dịch chiết, ngồi enzyme cịn chứa các protein tạp và nhiều chất khác, để loại bỏ chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác nhau.
ðể loại bỏ muối và các tạp chất cĩ phân tử lượng thấp thường dùng các biện pháp thẩm tích đối với nước hay đối với các dung dịch đệm lỗng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex.
ðể loại bỏ các protein tạp và các tạp chất cĩ phân tử lượng cao khác, thường dùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của mơi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung mơi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel.
Phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của mơi trường chỉ dùng đối với trường hợp của các enzyme bền nhiệt hoặc bền axit. Dịch enzyme đươc giữ ở 50-70oC hay ở pH = 5 hoặc nhỏ hơn trong thời gian xác định sau đĩ protein tạp đã bị biến tính được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm.
Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2SO4 dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein (enzyme) ở một nồng độ muối (tính theo % nồng độ bão hồ) xác định được dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu protein tạp của các dịch enzyme. Cũng cĩ thể kết tủa phân đoạn bằng các dung mơi hữu cơ. Phương pháp này chỉ dùng với những enzyme ít bị biến tính bởi các dung mơi hữu cơ được chọn dùng. ðể giữ cho enzyme khỏi bị mất khả năng hoạt động, quá trình phải đươc thực hiện ở nhiệt độ thấp (-5o
C).
Phương pháp hấp phụ chọn lọc – hấp phụ “trong thể tích” (thêm chất hấp phụ trực tiếp vào dịch enzyme) hoặc trên cột (sắc ký hấp phụ) được dùng phổ biến trong việc tách và làm sạch enzyme. Chất hấp phụ chủ yếu thường được dùng là hydroxyapatit cho hiệu quả phân tách đặc biệt cao. Hấp phụ chọn lọc enzyme cĩ thể thực hiện bằng một trong hai cách: chất hấp phụ protein tạp hoặc hấp phụ enzyme. Quá trình hấp phụ thường được tiến hành ở 0oC. Enzyme sau đĩ đươc chiết bằng các dung mơi thích hợp.
Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa tên cơ sở phản ứng trao đổi ion giữa protein đđược tan trong nước hoặc dung dịch đệm lỗng và các tác nhân trao đổi ion. Tác nhân trao đổi ion cĩ thể là nhựa trao đổi ion hoặc các dẫn xuất ester của xelulloza (cacboxymetylxelluloza, dietylaminoetylxelluloza, trietylaminoetylxelluloza…). Phương pháp sắc ký trên dietylaminoetylxelluloza (DEAE-xelluloza) cĩ ưu điểm là với dịch chiết thích hợp ngồi tạp chất protein cịn cĩ khả năng loại bỏ các tạp chất axit nucleic. ðiều đĩ cho phép khơng cần dùng đến các biện pháp nhằm loại bỏ axit nucleic khĩ và phức tạp như kết tủa protamin hoặc streptomixin sunfat thường được dùng trước đây.
Sephadex là dẫn xuất của polysacarit dextran trong đĩ các phân tử của chúng liên kết với nhau bởi các liên kết ngang xuất hiện nhờ tác dụng của epiclohidrin tạo thành “sàng phân tử”. Số liên kết ngang tạo thành càng nhiều, kích thước của lỗ sàng phân tử càng nhỏ. Khi lọc và chiết bằng dung mơi thích hợp một hỗn hợp gồm nhiều chất trên cột sephadex, các chất phân tử cĩ kích thước nhỏ sẽ khuyếch tán vào bên trong các sephadex đã đươc ngâm trong dung dịch đệm, cịn các phân tử chất cĩ kích thước lớn hơn khơng cĩ khả năng đi vào các hạt sẽ đươc chiết nhanh khỏi cột. Vậy cơ sở của phương pháp lọc gel sephadex dựa vào sự khác nhau về kích thước, hình dạng và phân tử lượng của các enzyme (12700-1000000) cho phép tách và làm sạch enzyme bằng phương pháp lọc gel sephadex là phương pháp cĩ nhiều triển vọng.
Khơng cĩ phương pháp tách làm sạch chung cho các enzyme. ðể xây dựng phương pháp tách và làm sạch một enzyme nào đĩ cần biết lựa chọn và phối hợp một cách cĩ hiệu quả nhất các biện pháp tách và làm sạch khác nhau.