2.4.1.1. Chuẩn bị các mẫu phối hợp hóa chất nhóm pyrethroid
Việc phối hợp các hóa chất để giảm tính kháng của các quần thể muỗi đã được ứng dụng trong sản xuất các màn tẩm hóa chất tồn lưu lâu, và đã được Tổ chức Y tế Thế giới khuyến cáo sử dụng trong chương trình PCSR quốc gia trong đó có Việt Nam. Các mẫu hóa chất dùng cho thử nghiệm của chúng tôi được pha từ việc trộn hỗn hợp giữa Fendona 10SC với Icon 2,5CS là những hóa chất đã và đang được sử dụng trong chương trình phòng chống sốt rét Quốc gia. Trong quá trình nghiên cứu trước khi áp dụng trong thực tế, chúng tôi đã có nghiên cứu khẳng định không có sự tương tác giữa các hóa chất được trộn để tạo ra một dạng hóa chất mới bằng kỹ thuật sắc ký. Các mẫu hỗn hợp hóa chất đều cho ra hai đỉnh đặc trưng cho riêng Fendona 10SC với Icon 2,5CS. Hóa chất được trộn dựa trên cơ sở lấy hóa chất Icon 2,5CS làm gốc và giảm liều lượng, thay vào đó là Fendona 10SC, sau đó
23
trộn đều với nhau tạo ra hỗn hợp thu được có tổng liều không vượt quá ngưỡng khuyến cáo của WHO và liều quy định của chương trình phòng chống sốt rét Quốc gia (20 – 30 mg/ m2). Liều Icon đơn thuần (I0) tẩm màn: 20 mg/m2; liều Fendona đơn thuần (F0) phun tường là 30 mg/m2.
Bảng 2.1. Các mẫu hỗn hợp đã được pha để thử nghiệm
TT Ký hiệu mẫu Liều lượng hỗn hợp (mg/m2)
Icon Fendona Tổng liều
1 I0 (Icon) 20 0 20
2 F0 (Fendona) 0 30 30
3 IF1 10 20 30
4 IF2 10 15 25
5 IF3 10 10 20
Bảng 2.2. Lượng hóa chất và lượng nước để pha dung dịch tẩm màn cho 1 m2 màn và 1 màn đôi (16,5 m2).
TT Ký hiệu
mẫu
Diện tích (m2)
Lượng hóa chất (ml) Lượng nước (ml) Lượng dung dịch khi đã pha (ml) Icon Fendona 1 I0 1 m2 0,8 0 41,62 42,42 16,5 m2 13,2 0 686,8 700 2 IF1 1 m2 0,4 0,2 41,82 42,42 16,5 m2 6,6 3,3 690,1 700 3 IF2 1 m2 0,4 0,15 41,87 42,42 16,5 m2 6,6 2,48 690,92 700 4 IF3 1 m2 0,4 0,1 41,92 42,42 16,5 m2 6,6 1,65 691,75 700
24
Bảng 2.3. Lượng hóa chất và lượng nước để pha dung dịch phun 200 m2 và 50 m2 tường
2.4.1.2. Xác định liều tối ưu của hỗn hợp hóa chất đối với chủng muỗi trong phòng thí nghiệm
Xác định mức độ nhạy cảm của An. dirus (chủng PTN)
Quy trình thử theo quy trình chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO/CDS/CPC/MAL/98.12) [56].
- Nguyên vật liệu:
+ Muỗi thử nghiệm: Muỗi An. dirus cái, 3 - 5 ngày tuổi, nuôi trong phòng thí
nghiệm, chưa hút máu, cho hút gluco 10%; muỗi khỏe mạnh, đủ chân, đủ cánh (sau đây gọi chung là muỗi đủ tiêu chuẩn). Số lượng muỗi thử nghiệm cho một hóa chất tối thiểu là 100 con và đối chứng 20 con.
TT Ký hiệu
mẫu
Diện tích (m2)
Lượng hóa chất (ml) Lượng nước (ml) Lượng dung dịch khi đã pha (ml) Icon Fendona 1 F0 200 m2 0 60 7940 8000 50 m2 0 15 1985 2000 2 IF1 200 m2 80 40 7880 8000 50 m2 20 10 1970 2000 3 IF2 200 m2 80 30 7890 8000 50 m2 20 7,5 1972,5 2000 4 IF3 50 m2 80 20 7900 8000 200 m2 20 5 1975 2000
25
+ Giấy tẩm các loại hóa chất dùng để thử nghiệm do WHO cung cấp: Alphacyhalothrin 30 mg/ m2, Lambdacyhalothrin 0,05%. Giấy đối chứng là những giấy chỉ tẩm các dung môi để hòa tan các chất đó. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Bộ dụng cụ thử nhạy cảm theo tiêu chuẩn của WHO gồm: 12 ống nhựa cứng, trong suốt, hình trụ, chiều dài 125 mm, đường kính 44 mm, hai đầu ống có ren: một đầu lắp vào nắp đậy có lưới nhựa, một đầu lắp vào tấm đế; 6 tấm đế; 6 tờ giấy trắng sạch; 12 kẹp kim loại dạng vòng tròn; 2 ống hút muỗi; ôn ẩm kế; đồng đồ bấm giây, dung dịch gluco 10% và một số dụng cụ khác.
- Cách tiến hành:
+ Dùng ống hút hoặc tube thủng hai đầu để bắt muỗi, cho muỗi vào ống nghỉ đã lót giấy trắng sạch trong thời gian 1 giờ. Sau đó chuyển muỗi sang ống tiếp xúc đã lót giấy tẩm hóa chất cần thử (hoặc giấy đối chứng nếu là ống đối chứng). Mỗi ống chỉ thử tối đa là 20 con muỗi trong một lần thí nghiệm.
Điều kiện thử nghiệm: nhiệt độ: 270C ± 20C; độ ẩm: 80% ± 10%.
+ Để ống tiếp xúc ở vị trí thẳng đứng, đầu ống có lưới hướng lên trên. Thời gian muỗi tiếp xúc với giấy tẩm hóa chất là 60 phút, sau đó chuyển muỗi trở lại ống nghỉ và đặt một miếng bông tẩm nước đường gluco 10% lên trên nắp lưới, giữ ở nơi tách biệt.
+ Sau 24 giờ, đếm số muỗi sống và số muỗi chết, ghi lại theo mẫu in sẵn.
+ Nếu tỷ lệ muỗi chết trong lô đối chứng > 20%: hủy bỏ kết quả và làm lại thử nghiệm.
+ Nếu tỷ lệ muỗi chết trong lô đối chứng trong khoảng 5% - 20%: Tỷ lệ muỗi chết được điều chỉnh theo công thức Abott:
Tỷ lệ(%) muỗi chết TN – Tỷ lệ(%) muỗi chết ĐC
Tỷ lệ (%) muỗi chết = x 100 100 - Tỷ lệ (%) muỗi chết ĐC
+ Nếu tỷ lệ muỗi chết trong lô đối chứng < 5%: giữ nguyên tỷ lệ chết quan sát mà không cần điều chỉnh.
26
- Đánh giá:
+ Tỷ lệ muỗi chết 98% - 100%: muỗi nhạy cảm với hóa chất thử nghiệm. + Tỷ lệ muỗi chết 80% - 97%: muỗi có thể kháng với hóa chất thử nghiệm. + Tỷ lệ muỗi chết < 80%: muỗi kháng với hóa chất thử nghiệm.
Thử nghiệm hiệu lực xua diệt của hỗn hợp hóa chất trong buồng thử Glass Chamber
- Phương pháp: Thử tác dụng xua diệt muỗi của một số liều phối hợp so với liều đơn bằng khảo nghiệm đánh giá hiệu lực, an toàn của hóa chất diệt côn trùng trong buồng thử Glass Chamber [2].
- Nguyên vật liệu:
+ Muỗi thử nghiệm: Muỗi thử nghiệm: là muỗi An. dirus đủ tiêu chuẩn. Số lượng
muỗi thử nghiệm cho một hóa chất tối thiểu là 60 con và đối chứng là 60 con. + Lồng thử nghiệm: lồng thử bằng kính, kích thước 70 x 70 x 70 (cm)
- Cách tiến hành:
+ Thả vào lồng thử 20 con muỗi An. dirus đủ tiêu chuẩn. Phun 1,5 – 2 ml hóa chất
cần thử /5 giây vào lồng.
+ Theo dõi số lượng muỗi quỵ trong suốt thời gian 20 phút.
+ Sau 20 phút thu thập muỗi được thử trên ra lồng sạch và nuôi bằng nước đường gluco 10%. Sau 24 giờ, tính tỷ lệ muỗi chết. Các bước ở lô đối chứng và thí nghiệm tương tự nhau. Mỗi mẫu thử phải tiến hành ít nhất 3 lần.
+ Nếu tỷ lệ muỗi chết ở lô đối chứng > 20%: hủy bỏ kết quả và làm lại thử nghiệm. + Nếu tỷ lệ muỗi chết trong lô đối chứng trong khoảng 5% - 20%: Tỷ lệ muỗi chết được điều chỉnh theo công thức Abott:
Tỷ lệ (%) muỗi chết TN – Tỷ lệ (%) muỗi chết ĐC
Tỷ lệ (%) muỗi chết = x 100
100 - Tỷ lệ (%) muỗi chết ĐC
+ Nếu tỷ lệ muỗi chết trong lô đối chứng < 5%: giữ nguyên tỷ lệ chết quan sát mà không cần điều chỉnh.
27 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Tỷ lệ muỗi chết từ 90% - 100%: hoá chất có tác dụng diệt tốt. + Tỷ lệ muỗi chết từ 70% - 90%: hoá chất có tác dụng diệt trung bình. + Tỷ lệ muỗi chết từ < 70%: hoá chất có tác dụng diệt kém.
- Từ kết quả của thử nghiệm trên, xác định được thời gian ngã ngục sau tiếp xúc (KT50, KT90) và tỷ lệ muỗi chết sau 24 giờ. Cuối cùng lựa chọn được liều phối hợp tối ưu.
2.4.1.3. Xác định hiệu lực diệt tồn lưu của hỗn hợp hóa chất đối với các mẫu màn và tường vách trong điều kiện PTN
Sử dụng 5 mẫu hóa chất là I0, F0, IF1, IF2, IF3 để tẩm màn và phun tồn lưu trong phòng thí nghiệm.
a. Quy trình tẩm màn
- Dụng cụ: 8 màn tuyn mới (cần được giặt sạch và phơi khô trước khi tẩm hóa chất), chậu, xô để chứa nước, nhúng màn, ống đong nước, cốc đong hóa chất, nilon tấm để trải phơi màn, găng tay cao su, quần áo bảo hộ lao động, khẩu trang, kính mắt. - Hóa chất: 4 mẫu hóa chất là I0, IF1, IF2, IF3
- Phương pháp (tẩm cho 2 màn/1 mẫu hóa chất): theo quy định và hướng dẫn của Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương [23].
+ Lắc đều hóa chất rồi đong lượng hóa chất và lượng nước tẩm đủ cho 2 màn theo bảng 3, khuấy thật đều cho hóa chất tan hết trong nước. Sau đó lấy lượng dung dịch đã pha đủ để tẩm cho 1 màn cho vào 1 cái chậu khác.
+ Màn được tẩm từng chiếc một. Cho màn vào chậu đã có dung dịch hóa chất hòa tan, nhồi màn cho thật kỹ sao cho dung dịch tẩm ngấm đều vào toàn bộ màn. Kiểm tra bằng cách nâng màn lên và quan sát xem màn đã ướt đều là được.
+ Phơi màn: sau khi tẩm hóa chất, gập màn làm đôi và trải màn nằm ngang trên tấm nilon trong bóng mát, để khô tự nhiên. Không phơi màn dưới ánh nắng mặt trời. Sau khi khô, màn sẽ được treo trong phòng thí nghiệm trong suốt thời gian thử nghiệm.
28
- Dụng cụ: 8 mẫu gỗ (kích thước 20 x 20 cm), bình phun bằng tay nén khí, ống đong hóa chất, que khuấy, nước sạch, phễu lọc nước, quần áo bảo hộ lao động, kính mắt, khẩu trang, mũ, ủng.
- Hóa chất: 4 mẫu hóa chất là F0, IF1, IF2, IF3 (phun cho 2 mẫu gỗ/1 mẫu hóa chất). - Phương pháp:
+ Xếp 2 mẫu tường gỗ thử nghiệm (kích thước 20 cm x 20 cm) sát nhau, gắn lên tường.
+ Lắc thật kỹ mẫu hóa chất, đong lượng hóa chất cho vào bình phun theo đúng liều lượng quy định theo bảng 2.3 phun cho 50 m2 tường, đổ nước sạch vào bình phun đúng với lượng nước quy định pha (nếu nước không thật sạch thì đổ vào bình phun qua phễu lọc để tránh tắc đầu vòi phun). Sau đó dùng que khuấy khuấy đều hóa chất với nước.
+ Đậy nắp bình phun, để bình phun ở nơi bằng phẳng.
+ Phun theo quy định và hướng dẫn của Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương [23].
+ Sau khi phun hết 50 m2 tường, lấy 2 mẫu gỗ để khô tự nhiên trong phòng thí nghiệm.
Đánh giá hiệu lực diệt tồn lưu của màn tẩm và tường phun các hỗn hợp hóa chất trong phòng thí nghiệm
a. Xác định hiệu lực tồn lưu của hóa chất diệt côn trùng trên màn
Thử sinh học được tiến hành ngay sau khi tẩm màn 24 giờ và hàng tháng cho đến khi tỷ lệ muỗi chết dưới 70%. Khi tỷ lệ chết dưới 70% sẽ tiến hành thử sinh học thêm 1 tháng tiếp theo để khẳng định hiệu lực hóa chất đã giảm (thử nghiệm khẳng định). Khi tỷ lệ muỗi chết dưới 70% trong 2 lần thử thì không cần phải thử thêm nữa.
Quy trình thử theo quy trình chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới WHO (WHO/VBC/89.981) [58]
29
+ Muỗi An. dirus cái đủ tiêu chuẩn. Số lượng muỗi thử nghiệm cho một hóa chất tối
thiểu là 50 con và đối chứng là 20 con.
+ Mẫu màn thử nghiệm: mỗi màn lấy ít nhất là 5 mảnh kích thước 30 cm x 30 cm ở 5 vị trí khác nhau: giữa đình màn, giữa hai thân lớn và giữa hai thân bé. Mỗi mảnh màn cắt ra được gói vào giấy thiếc và ghi mã số riêng bảo quản trong quá trình thử nghiệm ở nhiệt độ 27 ± 20C.
Mẫu màn đối chứng: 2 mảnh được cắt từ màn không tẩm hóa chất, bảo quản, ghi mã số giống như mẫu màn thử nghiệm.
+ Bộ thử tồn lưu theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới: phễu nhựa trong, hình nón, đường kính đáy là 8,5 cm, chiều cao 5,5 cm dùng để giữ cho muỗi tiếp xúc với mẫu thử nghiệm, mẫu đối chứng; ống hút muỗi; giá thử, ôn ẩm kế, đồng hồ bấm giây và một số dụng cụ khác cho muỗi nghỉ.
- Cách tiến hành:
Cho muỗi An. dirus đủ tiêu chuẩn vào phễu thử và tiếp xúc với mẫu màn 3 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
phút, sau đó nhẹ nhàng chuyển sang cốc giấy, đặt miếng bông tẩm nước đường. Ghi lại số muỗi bị ngã gục sau 60 phút và tỷ lệ chết sau khi tiếp xúc 24 giờ. Đối chứng: muỗi tiếp xúc với màn không có hóa chất được dùng làm đối chứng, thử nghiệm tiến hành ở nhiệt độ 27 ± 20C và độ ẩm 80% ± 10%.
- Đánh giá:
+ Nếu tỷ lệ muỗi chết ≥ 70%: Hóa chất còn hiệu lực tồn lưu. + Nếu tỷ lệ muỗi chết < 70%: Hóa chất hết tác dụng tồn lưu.
b. Xác định hiệu lực tồn lưu của hóa chất diệt côn trùng trên tường gỗ
Thử sinh học được tiến hành ngay sau khi phun 24 giờ và hàng tháng cho đến khi tỷ lệ muỗi chết dưới 50%. Khi đó sẽ tiến hành thử sinh học thêm 1 tháng để khẳng định hiệu lực hóa chất đã giảm (thử nghiệm khẳng định). Nếu tỷ lệ muỗi chết trên tường gỗ < 50% trong hai lần thử thì không phải thử thêm nữa.
- Phương pháp:
Quy trình thử theo quy trình chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới WHO (WHO/VBC/81.5) [59].
30
- Nguyên vật liệu:
+ Muỗi An. dirus cái đủ tiêu chuẩn.
+ Mẫu tường gỗ: kích thước 20cm x 20 cm.
Mẫu tường gỗ đối chứng: kích thước như trên nhưng không phun hóa chất.
+ Bộ thử tồn lưu theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới: phễu nhựa trong được gắn băng dính xốp, ống hút muỗi, cuộn băng dính, ôn ẩm kế, đồng hồ bấm giây và một số dụng cụ khác cho muỗi nghỉ.
- Cách tiến hành:
Cho muỗi An. dirus đủ tiêu chuẩn tiếp xúc với bề mặt tường 30 phút (10 con
muỗi/ phễu), sau đó nhẹ nhàng chuyển muỗi sang cốc giấy, đặt miếng bông tẩm nước đường lên miệng cốc.
Đếm và ghi số muỗi bị ngã gục sau 30 phút và số muỗi chết sau tiếp xúc 24 giờ.
Đối chứng: muỗi tiếp xúc với tường vách không phun hóa chất (điều kiện nhiệt độ 27 ± 20C và độ ẩm 80% ± 10%).
- Đánh giá:
+ Nếu tỷ lệ muỗi chết ≥ 50%: Hóa chất còn hiệu lực tồn lưu. + Nếu tỷ lệ muỗi chết < 50%: Hóa chất hết tác dụng tồn lưu.
So sánh tỷ lệ muỗi chết khi thử nghiệm với các hóa chất khác nhau theo thời gian giữa các mẫu phối hợp hóa chất, chọn ra 01 mẫu hỗn hợp hóa chất tốt nhất để phun tồn lưu và 01 mẫu hỗn hợp hóa chất tốt nhất để tẩm màn tại thực địa.
Đánh giá tác dụng không mong muốn đối với người tiếp xúc trực tiếp với hóa chất: + Người trực tiếp chuẩn bị mẫu màn và mẫu tường vách.
+ Người thử nghiệm các mẫu màn và mẫu tường vách hàng tháng.
- Phương pháp đánh giá: Phát bảng kiểm, yêu cầu tích vào các ô của bảng kiểm theo yêu cầu.
- Phân tích kết quả: So sánh tỷ lệ tác dụng không mong muốn bằng phần mềm Epi.info 6.0.
31