3.2.1. Số alen, hệ số PIC, tổng số băng thể hiện trên từng cặp mồi
Sau khi tách chiết đƣợc DNA tổng số của 60 giống lúa, chúng tôi tiến hành PCR với 33 cho đa hình trong tổng số 40 cặp mồi SSR nghiên cứu. Kết quả thu đƣợc trình bày ở bảng 3.1; hình 3.2 đến 3.8.
Bảng 3.1. Số alen thể hiện, số alen hiếm và hệ số PIC của 33 cặp mồi SSR
TT SSR locus Số alen
Số alen hiếm
Hàm lƣợng thông tin đa hình (PIC)
Kích thƣớc (bp) 1 RM18 3 1 0,35 110 - 120 2 RM547 7 2 0,78 220 - 300 3 RM17 6 3 0,61 164 - 189 4 RM223 6 1 0,72 110 - 165 5 RM283 2 0 0,35 147 - 150 6 RM20 5 2 0,55 137 - 170 7 MADS11 5 0 0,54 245 - 270 8 ADS20 5 2 0,59 300 - 340 9 RM307 7 4 0,69 120 - 138 10 RM5 7 2 0,64 108 - 123 11 RM21 6 0 0,80 126 - 158 12 RM287 8 5 0,82 120 - 142 13 RM510 4 1 0,49 115 - 130 14 RM312 5 1 0,66 287 - 320 15 RM408 7 3 0,72 126 - 137 16 RM585 5 2 0,57 162 - 210 17 RM19 8 4 0,66 230 - 314 18 RM162 4 1 0,45 285 - 347 19 RM206 7 2 0,78 153 - 169 20 RM222 2 1 0,06 266 - 278 21 RM171 2 0 0,34 350 - 375 22 RM241 7 4 0,72 165 - 190 23 RM300 7 2 0,76 135 - 167 24 RM277 3 1 0,35 120 - 128 25 RM25 6 2 0,62 138 - 161
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 26 RM133 4 0 0,52 230 - 270 27 RM190 7 3 0,72 115 - 129 28 RM148 3 0 0,56 125 - 136 29 RM247 7 3 0,53 130 - 212 30 RM38 4 0 0,61 286 - 295 31 RM72 10 4 0,83 162 - 210 32 RM270 5 2 0,56 111 - 127 33 RM276 6 3 0,74 170 - 230
Số liệu ở bảng 3.1 cho thấy, số lƣợng alen rất khác nhau giữa các locus. Trong tổng số 40 chỉ thị SSR đƣợc sử dụng nghiên cứu có 33 (82,5%) chỉ thị cho đa hình với tổng cộng 180 alen. Số lƣợng alen dao động từ 2 đến 10 alen, có 3 cặp mồi cho 2 alen (RM283, RM222, RM171), có đến 8 cặp mồi cho 7 alen (RM547, RM307, RM5, RM408, RM206, RM241, RM300, RM190, RM247), riêng cặp mồi RM72 cho 10 alen, giá trị trung bình là 5,45 alen/locus. Với giá trị trung bình 5,45 alen/locus chứng tỏ các giống lúa nghiên cứu có độ đa hình khá cao, điều này rất có ý nghĩa trong công tác chọn tạo và xác định giống lúa. Kết quả này cũng cao hơn so với kết quả nghiên cứu của Ashfaq và cộng sự (2012) khi nghiên cứu sự đa dạng di truyền giống lúa Basmati cho 3,6 alen/locus và Rahman và cộng sự (2012) khi nghiên cứu đa dạng di truyền các giống lúa ƣu tú ở Bangladesh với giá trị trung bình là 4,18 alen cho mỗi locus. Tuy nhiên, số alen trung bình này lại thấp hơn hẳn so với Thomson và cộng sự (2007) khi nghiên cứu về đa dạng di truyền các giống lúa bản địa ở Indonesia với số alen trung bình là 13 alen mỗi locus.
Hệ số PIC đƣợc coi là thƣớc đo tính đa dạng di truyền của các alen ở từng locus SSR, giá trị PIC có thể đƣợc hiểu nhƣ là sự đa dạng di truyền của gen. Nhƣ vậy, hệ số PIC của cặp mồi nào cao thì phản ánh độ đa dạng di truyền càng cao trong phân tích đa dạng di truyền của tập đoàn lúa nghiên cứu và ngƣợc lại. Hàm lƣợng thông tin đa hình (PIC) của 33 chỉ thị SSR dao động
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
từ 0,06 đến 0,83, trung bình đạt 0,60. Hệ số PIC trung bình đạt 0,60 cho thấy mức độ đa dạng nguồn gen của các giống lúa là khá đa dạng. Kết quả này cũng tƣơng tự so với một số công bố trƣớc đây, Lapitan và cộng sự (2007) khi đánh giá đa dạng di truyền giống lúa chất lƣợng ở Philippin đã chỉ ra hệ số PIC trung bình của các giống lúa 0,68 trên mỗi locus. Ravi và cộng sự (2003), Jain và cộng sự (2004) cũng chỉ ra hệ số PIC trung bình 0,582; 0,61. Hệ số PIC này cao hơn so với một số nghiên cứu nhƣ: Sajib và cộng sự (2012), Hossain và cộng sự (2012) với hệ số PIC trung bình lần lƣợt là 0,48; 0,508. Tuy nhiên, hệ số PIC trung bình trong nghiên cứu này cũng thấp hơn hệ số PIC trung bình của Shaptadvipa và cộng sự (2009), Borba và cộng sự (2009), Upadhyay và cộng sự (2011) với hệ số PIC trung bình lần lƣợt là 0,923; 0,75; 0,78.
3.2.2. Các alen hiếm và alen đặc trƣng
Các alen hiếm cũng đƣợc tìm thấy trong nghiên cứu này (bảng 3.1). Theo Jain và cộng sự (2004) alen đƣợc coi là hiếm nếu tần số xuất hiện của chúng nhỏ hơn hoặc bằng 5% tổng số các kiểu gen phân tích. Trong số các locus đa hình, tạo ra tổng cộng 61 alen hiếm. Chỉ thị RM287 cho số lƣợng alen hiếm cao nhất với 5 alen, tiếp đó là các chỉ thị RM307, RM19, RM241 và RM72 với 4 alen hiếm mỗi locus. Có 3 giống cho số alen hiếm nhiều nhất ở 6 locus đa hình đó là giống Tám thơm ấp bẹ (DS24), Thái Bonet thơm (DS36) và LC93-1 (DS50). Các alen hiếm ở trong tập đoàn giống sẽ cung cấp thông tin hữu ích cho các nhà di truyền học và chọn giống.
Ngoài ra, trong số các locus đa hình nghiên cứu có 11 locus cho các alen đặc trƣng ở 12 giống lúa nghiên cứu (bảng 3.2). Giống Nếp nõn tre (DS15) có thể nhận dạng đƣợc bằng chỉ thị RM276 và RM312 với kích thƣớc alen thu đƣợc khoảng 170 bp và 320 bp so với 60 giống lúa nghiên cứu. Ba chỉ thị là RM19, RM276 và RM241 cho hai alen đặc trƣng ở các giống. Tuy
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
nhiên các alen thu đƣợc có kích thƣớc khác nhau và giúp nhận dạng đƣợc các giống nhƣ Nếp 415, Thái Bonet thơm, Nếp vải, Nếp nõn tre, Nếp BM9603, Nếp nƣơng dạng 1, 2 với kích thƣớc alen lần lƣợt khoảng 290 bp, 250 bp, 200 bp, 170 bp, 190 bp và 185 bp.
Bảng 3.2. Các chỉ thị SSR cho alen đặc trưng ở 12 giống lúa
TT Số đăng ký Tên giống Tên chỉ thị SSR Kích thƣớc alen (bp) 1 DS1 Nếp bồ hóng Hải Dƣơng RM223 165 bp 2 DS6 Nếp Hải Phòng RM72 173 bp 3 DS9 Nếp 415 RM547, RM19 220 bp, 290 bp 4 DS10 Nếp BM9603 RM241 190 bp 5 DS14 Nếp vải RM276 200 bp 6 DS15 Nếp nõn tre RM276,RM312 170 bp, 320 bp 7 DS17 Nếp MTL668 RM5 108 bp 8 DS19 Nếp nƣơng dạng 1, 2 RM241 185 bp 9 DS22 Khẩu pe RM247 210 bp 10 DS26 Tám cao cây RM190 129 bp
11 DS36 Thái Bonet thơm RM19 250 bp
12 DS55 ĐB6 RM287 130 bp
Ảnh điện di trên gel polyacrylamide của một số mồi cho đa hình đƣợc thể hiện từ hình 3.2 đến hình 3.8.
Hình 3.2. Ảnh điện di trên gel polyacrylamide của cặp mồi RM18 với các
mẫu lúa D1 – DS60 tương ứng với số 1-60 (bảng 2.1)
125 bp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Dựa vào kết quả điện di thể hiện trên hình 3.2, cho thấy 60 giống lúa nghiên cứu cho băng DNA gọn, rõ nét. Kích thƣớc các băng dao động từ 110 bp đến 120 bp hoàn toàn phù hợp với kích thƣớc lý thuyết của các cặp mồi.
Hình 3.3. Ảnh điện di trên gel polyacrylamide của cặp mồi RM510 với các
mẫu lúa DS1 - DS25 tương ứng với số 1-25 (bảng 2.1)
Kết quả điện di cặp mồi RM510 thu đƣợc 4 alen đa hình, tuy tỉ lệ đa hình của các giống lúa không cao nhƣng băng DNA thu đƣợc gọn và rõ nét, kích thƣớc các băng phân tách rõ ràng. Đây là một yêu cầu rất quan trọng đối với một chỉ thị phân tử dùng trong nghiên cứu.
Hình 3.4. Ảnh điện di trên gel polyacrylamide của cặp mồi RM20 với các (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
mẫu lúa DS1 - DS25 tương ứng với số 1-25 (bảng 2.1)
Hình 3.5. Ảnh điện di trên gel polyacrylamide của cặp mồi RM17 với các
mẫu lúa DS1 – DS60 tương ứng với số 1-60 (bảng 2.1)
125 bp
150 bp
175 bp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Cặp mồi RM17 cho tỷ lệ đa hình khá cao với 6 alen, kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.5. Dựa vào hình 3.5 cho thấy, kích thƣớc các băng DNA phân tách khá rõ ràng dao động trong khoảng từ 164 bp đến 189 bp. Có 5 giống có alen hiếm nằm ở giếng số 28, 35, 8, 20, 42 tƣơng ứng với các giống Jasmin 85 (DS28), nàng hoa 9 (DS35), nếp rồng Hà Bắc (DS8), khẩu nu na (DS20), Q5 (DS42).
Hình 3.6. Ảnh điện di trên gel polyacrylamide của cặp mồi RM223 với các
mẫu lúa DS1 - DS25 tương ứng với số 1-25 (bảng 2.1)
Cặp mồi RM223 cho 6 alen, trong đó có 1 alen đặc trƣng giúp nhận dạng giống nếp bồ hóng Hải Dƣơng (DS1) trong tổng số 60 giống lúa nghiên cứu, băng DNA tƣơng ứng với alen đặc trƣng này nằm ở giếng số 1 trên hình 7 và có kích thƣớc khoảng 165 bp. Alen đặc trƣng là công cụ hữu hiệu giúp nhận dạng các giống lúa hiện nay.
Hình 3.7. Ảnh điện di trên gel polyacrylamide của cặp mồi RM19 với các
mẫu lúa DS30 – DS55 tương ứng với số 1-25 (bảng 2.1)
150 bp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.8. Ảnh điện di trên gel polyacrylamide của cặp mồi RM72 với các
mẫu lúa DS1 – DS60 tương ứng với số 1-60 (bảng 2.1)
Cặp mồi RM72 là cặp mồi cho nhiều băng DNA đa hình nhất với 10 alen. Kích thƣớc các băng DNA dao động từ 162 bp đến 210 bp. Dựa vào kết quả điện di trên hình 7 cho thấy, giếng số 34, 36, 37, 40, 44 tƣơng ứng với các giống Basmati 370 (DS34), thái Bonet thơm (DS36), OM4101 (DS37), FL478 (DS40), KDĐB (DS44), xuất hiện cùng lúc hai băng DNA, điều đó chứng tỏ trên locus này có kiểu gen dị hợp tử. Kiểu gen dị hợp tử sẽ làm tăng tính đa dạng di truyền trong các giống lúa đồng thời cũng là nguồn vật liệu quan trọng cho công tác chọn tạo giống sau này. Ngoài ra cặp mồi RM72 còn cho 1 alen đặc trƣng kích thƣớc khoảng 173 bp giúp nhận dạng giống nếp Hải Phòng (DS6) của Việt Nam (giếng số 6 trên hình 3.8).
3.2.3. Tỉ lệ khuyết số liệu (M) và tỉ lệ dị hợp tử (H) của các giống lúa nghiên cứu nghiên cứu
SSR là chỉ thị đồng trội, do đó có thể phân biệt đƣợc những mẫu mang kiểu gen dị hợp và những mẫu mang kiểu gen đồng hợp. Tỉ lệ dị hợp tử (H) đƣợc tính bằng tỉ lệ giữa tổng số mồi có xuất hiện 2 alen/1 locus SSR với hiệu của tổng số mồi nghiên cứu trừ đi số mồi không xuất hiện băng DNA trên một giống xác định.
Tỉ lệ khuyết số liệu (M) phản ánh số liệu bị khuyết trên từng giống, đƣợc tính bằng tỉ lệ số mồi không xuất hiện băng với tổng số mồi nghiên cứu đối với một giống xác định. Tỉ lệ khuyết số liệu càng thấp phản ánh tính chính xác của kết quả nghiên cứu. Kết quả tỉ lệ khuyết số liệu (M) và tỉ lệ dị hợp tử (H) của các giống lúa nghiên cứu thể hiện ở Bảng 3.3.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 3.3. Tỉ lệ khuyết số liệu (M) và tỉ lệ dị hợp tử (H) của các giống lúa
nghiên cứu Số đăng ký Tên giống M (%) H (%) Số đăng ký Tên giống M (%) H (%) DS1 Nếp bồ hóng Hải Dƣơng 0,00 3,03 DS31 TL6 0,00 0,00 DS2 Nếp cẩm đen 0,00 3,03 DS32 TĐB6 0,00 0,00
DS3 Khẩu lao 3,03 0,00 DS33 Hƣơng chiêm 9,09 3,33
DS4 Blaodang 0,00 0,00 DS34 Basmati 370 0,00 3,03
DS5 Nếp hoa vàng 1 0,00 0,00 DS35 Nàng Hoa 9 0,00 0,00
DS6 Nếp Hải Phòng 0,00 0,00 DS36 Thái Bonet
thơm 0,00 3,03 DS7 Nếp IRi352 0,00 0,00 DS37 OM4101 0,00 3,03 DS8 Nếp rồng Hà Bắc 9,09 0,00 DS38 Lúa nàng nhen thơm 0,00 0,00 DS9 Nếp 415 0,00 0,00 DS39 IR64-Sub I 0,00 0,00 DS10 Nếp BM9603 0,00 0,00 DS40 FL478 6,06 3,22
DS11 Nếp Dầu Hƣơng 9,09 0,00 DS41 OM6975 0,00 0,00 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
DS12 Nếp ruộng 1 0,00 0,00 DS42 Q5 0,00 0,00
DS13 Nếp bò 0,00 0,00 DS43 Q5ĐB 0,00 0,00
DS14 Nếp vải 0,00 0,00 DS44 KDĐB 0,00 3,03
DS15 Nếp nõn tre 0,00 0,00 DS45 Khang dân 18 0,00 0,00
DS16 Nếp hoa vàng 2 6,06 6,45 DS46 LT2 0,00 0,00 DS17 Nếp MTL668 0,00 0,00 DS47 Lƣỡng Quảng 164 0,00 12,12 DS18 Nếp lá xanh 0,00 0,00 DS48 Khâm dục 0,00 0,00 DS19 Nếp nƣơng dạng 1-2 0,00 0,00 DS49 Đoàn kết 0,00 0,00 DS20 Khẩu nu na 0,00 0,00 DS50 LC93-1 0,00 0,00
DS21 Khẩu tan hay 0,00 0,00 DS51 S103 0,00 0,00
DS22 Khẩu pe 0,00 0,00 DS52 BM9820 9,09 0,00
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Số liệu ở bảng 3.3 cho thấy tỉ lệ khuyết số liệu (M) cao nhất 9, 09% (tƣơng ứng với khuyết số liệu 3/33 cặp mồi) gồm ba giống là Hƣơng chiêm, FL478, nếp rồng Hà Bắc, tỉ lệ khuyết số liệu 6,06 (2/33 cặp mồi) thuộc giống nếp BM9603, nếp hoa vàng 2 tiếp đó hai giống Khẩu lao, tám xuân đài có tỉ lệ khuyết số liệu là 3,03 (1/33 cặp mồi), 53 giống còn lại có tỉ lệ khuyết số liệu là 0,00. Tỉ lệ khuyết số liệu của 60 giống lúa nghiên cứu trung bình là 0,91; Tỉ lệ khuyết số liệu trung bình này thấp hơn nghiên cứu của Vũ Thị Bích Huyền (2013) khi đánh giá đa dạng di truyền một số giống lúa bằng kỹ thuật SSR phục vụ xây dựng cặp lai cho tạo chọn giống chịu hạn với tỉ lệ khuyết số liệu trung bình là 1,69. Trong 60 giống lúa nghiên cứu không có giống nào có tỉ lệ khuyết số liệu lớn hơn 10 %. Nhƣ vậy, cả 60 giống đều có ý nghĩa phân tích thống kê.
Tỉ lệ dị hợp tử (H) cao nhất ở giống lƣỡng quảng 164 là 12,12 %, tiếp đến là giống tám xuân đài với 9,37 %. Tỉ lệ dị hợp tử 6,45 % xuất hiện ở giống nếp hoa vàng 2, giống Hƣơng chiêm là 3,33%, FL478 là 3,22 nếp cẩm đen, nếp bồ hóng Hải Dƣơng, nếp cẩm đen, Basmati 370, OM4101, KDĐB đều cho tỉ lệ dị hợp tử là 3,03%. Năm mƣơi giống còn lại có tỉ lệ dị hợp tử 0,00% (đồng hợp ở cả 22 locus nghiên cứu). Tỉ lệ dị hợp tử trung bình của cả tập đoàn là 0,87. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Khuất Hữu Trung và cộng sự (2010) khi nghiên cứu đa dạng di truyền tập
Dƣơng
DS24 Tám thơm ấp bẹ 0,00 0,00 DS54 LT3 0,00 0,00
DS25 Tám xuân đài 3,03 9,37 DS55 ĐB6 0,00 0,00
DS26 Tám cao cây 0,00 0,00 DS56 Nam Định 1 0,00 0,00
DS27 Bắc thơm số 7 0,00 0,00 DS57 BM9855 0,00 0,00
DS28 Jasmin 85 0,00 0,00 DS58 Bao thai 0,00 0,00
DS29 Hƣơng thơm số 1 0,00 0,00 DS59 Mộc tuyền 0,00 0,00
DS30 Hƣơng cốm 0,00 0,00 DS60 DT122 0,00 0,00
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
đoàn lúa Tám đặc sản Việt Nam cho tỉ lệ dị hợp tử trung bình là 0,86; tác giả Tabkhkar và cộng sự (2012) khi nghiên cứu đa dạng di truyền một số tính trạng liên quan đến nấu ăn và chất lƣợng ăn uống với tỉ lệ dị hợp tử trung bình là 0,72. Kết quả nghiên cứu tỉ lệ dị hợp tử trung bình 0,87 của chúng tôi cũng cao hơn trong báo cáo của Ghneim và cộng sự (2008) là 0,524 sử dụng 48 locus SSR trên 11 giống lúa Venezuela và tỉ lệ dị hợp tử trung bình 0,5 đƣợc ghi nhận trong báo cáo của Bounphanousay và cộng sự (2008). Ngoài ra, Kibria và cộng sự (2009) cũng thu đƣợc tỉ lệ dị hợp tử trung bình 0,119 trong phân tích kiểu gen lúa thơm. Tỉ lệ dị hợp tử phản ánh mức đa hình của giống, là căn cứ để xác định các giống trong nghiên cứu tiếp theo.
3.2.4. Quan hệ di truyền giữa các giống lúa nghiên cứu
Quan hệ di truyền giữa các giống lúa nghiên cứu đƣợc phân tích bằng phần mềm NTSYS 2.1, từ đó xác định đƣợc hệ số tƣơng đồng di truyền và sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa (Hình 3.9). Hệ số tƣơng đồng di truyền của các giống lúa dao động từ 0,056 đến 0,77, hai giống