Chuẩn bị bản gel polyacrylamide
Bản gel có kích thƣớc 19 x 50 cm gồm hai tấm kính, tấm kính ngắn không bám bản gel và tấm kính dài đƣợc gắn bản gel. Rửa sạch hai tấm kính trên 3 lần bằng nƣớc cất 2 lần. Sau đó lau khô bằng giấy lụa mềm, tiếp theo lau lại bằng giấy Kimwipe cho khô và sạch bụi. Trên tấm kính ngắn sử dụng dung dịch bôi trơn là Rain X thấm trên giấy Kimwipe, chờ từ 15 - 20 phút cho khô. Trên tấm kính dài sử dụng dung dịch dính gồm 1 ml hỗn hợp với 95 % cồn tuyệt đối, 0,5 % acetic acid và 3,0 μl bind silance. Để từ 15 - 20 phút cho khô. Đặt hai tấm spacer vào hai bên mép tấm kính rồi ghép hai tấm kính lại với nhau để tạo khuôn đúc gel, khi đó khuôn đúc có độ dày đúng bằng độ dày của thanh spacer.
Chuẩn bị gel chạy điện di
Dùng ống đong lấy 55 ml dung dịch polyacrylamide 5 %, bổ sung thêm 55 μl TEMED và 165 μl APS 10 %, trộn đều. Dùng xylanh 140 ml hút và bơm từ từ vào khoảng trống giữa hai tấm kính qua một lỗ ở đáy của hệ thống của bản gel. Khi thấy gel chảy ra gần mét ngoài, lắp lƣợc và gel, chờ từ 2 - 3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
giờ cho gel đông lại. Trong trƣờng hợp giữ gel qua đêm ở nhiệt độ phòng cần bịt đầu có lƣợc bằng màng plastic.
Tiến hành điện di
Sau khi gel đông, lắp bản gel vào hệ thống chạy điện di. Cho chạy thông gel trƣớc khi tra mẫu trong 20 - 30 phút ở công suất 75 W trong dung dịch đệm 0,5X TBE. Đệm tra mẫu gồm 2,5 mg Bromophenol blue; 2,5 mg Xylene cyanlo FF; 0,4 g sucrose, thêm nƣớc cất vừa đủ 1 ml.
Tra mẫu: sản phẩm chạy SSR thu đƣợc thêm 7 μl đệm tra mẫu, trộn đều. Biến tính ở 940C trong từ 8 đến 10 phút rồi cho ngay vào khay đá. Lấy 5 μl hỗn hợp đã biến tính lần lƣợt tra vào các giếng. Thƣờng tra marker 100 đầu tiên hoặc cuối cùng với một lƣợng khoảng 4 μl. Để tăng hiệu quả sử dụng cả gel, có thể tra mẫu nhiều lần, mỗi bản gel có thể tra từ 2 - 3 lần. Công suất chạy gel là 75 W, sau 1 - 2 giờ tắt máy, gỡ bản gel ra khỏi máy, tách bản kính không dính ra rồi tiến hành nhuộm bạc.
Chuẩn bị các dung dịch để nhuộm gel
Dung dịch cố định (1 lít) bao gồm 250 ml CH3COOH, thêm nƣớc cất cho đủ một lít, dung dịch này dùng đƣợc 2 lần. Dung dịch hiện (1 lít) bao gồm 30 gam sodium cacbonat, thêm vào 1,5 ml HCHO, thêm nƣớc cất cho đủ 1 lít. Đƣa vào tủ lạnh, dung dịch hiện chỉ dùng đƣợc một lần và chỉ phát huy tác dụng khi đƣợc giữ lạnh. Dung dịch nhuộm (1 lít), bao gồm 1 gam AgNO3, 1,5 ml HCHO, thêm nƣớc cất vừa đủ 1 lít, dung dịch dùng đƣợc hai lần.
Tiến hành nhuộm bản gel
Sau khi tách bản kính, đƣa vào dung dịch cố định đặt lên máy lắc trong 30 phút, đến khi không còn thấy các vạch nhuộm màu nữa. Rửa bản gel 2 lần bằng nƣớc cất, mỗi lần 3 phút. Nhuộm gel bằng dung dịch nhuộm trong 30 phút trên máy lắc. Rửa bản gel đã nhuộm thật nhanh bằng nƣớc cất, rửa không quá 10 giây. Cho bản gel đã rửa vào dung dịch hiện đã đƣợc làm lạnh ở 100C. Đặt lên máy lắc từ 5 đến 10 phút, cho đến khi thấy nổi rõ các băng điện di. Cố định gel bằng dung dịch cố định trong 3 - 5 phút, kết thúc phản ứng nhuộm. Rửa lại bản gel bằng nƣớc cất và để khô ở nhiệt độ phòng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/