DNA genome đƣợc tách từ các mẫu lá theo phƣơng pháp CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) của Saghai Maroof và cộng sự (1984) có cải tiến cho phù hợp với việc tách chiết DNA tổng số của các mẫu lúa. Quy trình thực hiện nhƣ sau:
Lá của các giống lúa đƣợc cắt làm mẫu sau khi gieo 2 - 3 tuần, sau đó nghiền mẫu lá trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ. Bột đã nghiền cho vào ống eppendorf 1,5 ml, thêm 0,7 ml đệm CTAB đã làm ấm ở 650C trong 10 phút. Để các ống trong bể ổn nhiệt ở điều kiện 650
C trong 90 phút, lắc nhẹ nhàng nhƣng dứt khoát 15 phút một lần để việc tách có hiệu quả. Chuyển các ống ở bể ổn nhiệt ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Thêm 0,7 ml dung dịch Chloroform/ Isoamyl alcohol (24: 1), lắc ống nhẹ nhàng 10 phút. Ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Dùng pipetman hút lớp trên cùng sang ống eppendorf 1,5 ml mới. Thêm Isopropanol theo tỉ lệ 1: 1. Sau đó xoay ống nhẹ nhàng vài phút. Để mẫu ở tủ - 200
C trong 1 giờ. Ly tâm tốc độ 10.000 vòng/ phút trong 10 phút. Bỏ phần dịch phía trên thu lấy tủa. Rửa tủa bằng cồn 70 % lạnh. Sau đó, thổi khô và hoà tan tủa bằng 0,5 ml TE pH 8,0. Bổ sung RNase đã đƣợc đun cách thuỷ trong 20 phút, sau đó ủ ở 370C trong 180 phút. Bổ sung hỗn hợp Phenol/ Chloroform/ Isoamyl alcohol (25: 24: 1) theo tỉ lệ 1: 1, lắc nhẹ trong 10 phút. Ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/ phút. Hút phần dịch trên sang ống eppendorf 1,5 ml mới, thêm 0,5 ml dung dịch chloroform/ isoamyl alcohol (24: 1), lắc ống nhẹ nhàng 10 phút. Ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/ phút trong 10 phút. Hút dịch nổi sang ống mới. Thêm cồn tuyệt đối lạnh theo tỉ lệ cồn: mẫu (2: 1) vào dịch nổi, bổ sung 15 μl NaCl
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
5 M sau đó lắc nhẹ. Ly tâm hỗn hợp 10.000 vòng/ phút trong 10 phút. Bỏ phần dịch nổi phía trên, thu tủa và rửa tủa bằng cồn 70 % lạnh. Thổi khô tủa trong 20 phút ở Laminar. Sau đó hoà tan tủa bằng TE. Giữ mẫu trong tủ 40C.
DNA genome sau khi tách chiết sẽ xác định hàm lƣợng và độ tinh sạch bằng quang phổ hấp phụ. Phƣơng pháp này đƣợc tiến hành nhƣ sau: đo OD ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm trên máy quang phổ kế UV-1601. Dựa vào sự hấp thụ mạnh ở bƣớc sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine của phân tử DNA mạch kép và mạch đơn, ngƣời ta sẽ đo đƣợc giá trị mật độ quang ở bƣớc sóng 260 nm (OD260 nm - Optical Density 260 nm) của các mẫu. Ở bƣớc sóng 280 nm, các protein có mức hấp thụ cao nhất, đồng thời cũng hấp thụ ở bƣớc sóng 260 nm nhƣ các axit nucleic và gây nên sự sai lệch giá trị thật khi tính nồng độ acid nucleic.
Nồng độ DNA đƣợc tính theo công thức sau: CDNA (µg/µl) = OD260 x 50 x hệ số pha loãng.
Độ sạch DNA = OD260 /OD280 (OD260, OD280 là chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm). Một dung dịch acid nucleic đƣợc coi là sạch (không lẫn protein) khi tỉ số OD260 nm /OD280 nm nằm trong khoảng 1,8 - 2,0.
Các bƣớc tiến hành
Lấy 1 ml dung môi hoà tan DNA (TE pH 8,0 hoặc nƣớc khử ion vô trùng) cho vào cuvette đo làm đối chứng. Cho 5 μl dung dịch DNA cần đo nồng độ vào 995 μl dung môi hoà tan DNA (pha loãng 200 lần). Sau đó cho vào cuvette và đo OD ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm.Từ kết quả đo đƣợc, tính nồng độ DNA theo công thức trên. Dựa vào nồng độ để pha loãng DNA ra nồng độ 25 ng/ ml bằng nƣớc để chuẩn bị chạy PCR với các mồi SSR theo công thức:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
N1 × V1 = N2 × V2
Trong đó N1: Nồng độ DNA ban đầu; V1: Thể tích cần lấy để pha; N2: Nồng độ DNA cần pha; V2: Thể tích cần pha
Kiểm tra DNA tách chiết đã đƣợc pha loãng bằng cách điện di trên gel agarose 1 %. Gel agarose đƣợc nhuộm trong ethidium bromide và chụp ảnh dƣới ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng 254 - 260 nm trên máy chụp ảnh gel CLS - Microdoc (Cleaver Scientific Ltd, Mỹ).