Lấy 1/4 vòng que cấy tế bào cho vào mỗi ống nghiệm chứa 2 ml dung dịch yeast nitrogen base vô trùng đã chuẩn bị trƣớc, lắc đều cho tế bào hòa đều vào trong dịch. Dùng pipet Paster vô trùng hoặc sử dụng pipetman với đầu côn vô trùng có màng lọc hút 30 µl dịch tế bào cho vào mỗi ống nghiệm môi trƣờng có nồng độ cycloheximide khác nhau và 1 ống đối chứng (chỉ có Yeast Nitrogen Base và D-Glucose). Ống nghiệm để trong tủ nuôi cấy ở 28°C trong vòng 3 tuần. Sau mỗi tuần đem quan sát và đọc kết quả. Chủng nào có khả năng chống chịu với cycloheximide sẽ phát triển.
2.4.17. Thử khả năng chống chịu với 1% acetic acid
Cấy chấm khuẩn lạc đã đƣợc trẻ hóa trên môi trƣờng Malt Glucose 2°Bx vào các đĩa môi trƣờng đã chuẩn bị nhƣ mục 2.3. Các đĩa nuôi cấy đƣợc đặt trong tủ nuôi cấy ở 28°C trong vòng 1 tuần, quan sát sự sinh trƣởng của khuẩn lạc, nếu các chủng mọc lên thành khuẩn lạc thì chứng tỏ các chủng đó có khả năng chống chịu acetic acid 1 %.
2.4.18. Phát hiện khả năng sinh sản hữu tính.
Việc phát hiện ra khả năng sinh sản hữu tính của nấm men có ý nghĩa rất quan trọng nhất là trong tiến hóa và phân loại vi sinh vật, cho đến nay trên thế giới chƣa phát hiện đƣợc hiện tƣợng sinh sản hữu tính ở Moniliella. Để nghiên cứu phát hiện pha sinh sản hữu tính chúng tôi tiến hành thí nghiệm nhƣ sau, các chủng trong cùng 1 loài sau khi đƣợc xác định qua fingerpringting và trình tự rDNA sẽ đƣợc trẻ hóa trên môi trƣờng Malt-Glucose 2°Bx, sau đó tế bào các chủng đƣợc trộn lẫn lần lƣợt với nhau trong nƣớc cất, nhỏ các dịch vào các môi trƣờng đĩa YM agar, Malt-Glucose 2°Bx agar, Yeast carbon base agar (môi trƣờng không có nguồn nito), Water agar, nuôi cấy các chủng ở 15°C và 5°C trong vòng 1 tuần, quan sát sự phát triển nấm men hàng ngày, soi dƣới kính hiển vi nhằm phát hiện pha sinh sản hữu tính của chúng.
Bảng 2. Phƣơng pháp trộn lẫn tế bào các chủng trong cùng 1 loài để phát hiện pha sinh sản hữu tính All Chủng 1 Chủng 2 Chủng 3 Chủng 4 Chủng 5 Chủng 1 x Chủng 2 x x Chủng 3 x x x Chủng 4 x x x x Chủng 5 x x x x x
Chƣơng 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả phân lập
Nhƣ những nghiên cứu trƣớc đây cho thấy Moniliella thƣờng phân lập đƣợc từ các sản phẩm do con ngƣời tạo ra, những nơi có nhiều dầu, mỡ hoặc những nơi có nồng độ đƣờng cao. Với mục đích nghiên cứu sự đa dạng của chi Moniliella tại Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành thu thập nhiều loại mẫu khác nhau nhƣ bàn thái thịt, lọ mỡ, nem chua, hoa, mật ong,… ở các địa điểm nhƣ Hà Nội, Lào Cai, Vĩnh Phúc, Hƣng Yên, Hải Dƣơng, Hòa Bình, Nam Định, Quảng Ninh, Thái Nguyên, Phú Thọ, Lâm Đồng, Bình Thuận, Phú Yên. Môi trƣờng dùng cho phân lập có thành phần nhƣ đã nêu, nhƣ vậy, ngoài các thành phần cơ bản là nguồn dinh dƣỡng còn có axit lactic. Axit lactic với nồng độ 1‰ tạo pH khoảng 4,5 trong môi trƣờng sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn.
Quá trình phân lập đƣợc tiến hành nhƣ mô tả trong phần phƣơng pháp. Sau khi nuôi cấy, các khuẩn lạc có màu sắc là các gam màu tối (xanh đen, đen...) hoặc từ màu vàng chuyển sang vàng xanh, vàng đen hay các khuẩn lạc có màu trắng, nhƣng bề mặt xốp, dễ gạt bằng que cấy đƣợc làm tiêu bản quan sát hình thái tế bào. Những chủng có tế bào có cả dạng hình cầu và hình que kèm theo đứt gãy nhiều đƣợc giữ lại để làm sạch và bảo quản trong các ống nghiệm thạch nghiêng nút cao su để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Sở dĩ vẫn giữ các khuẩn lạc có màu trắng là do các chủng nấm men đen khác nhau có thời gian chuyển màu khác nhau. Kết quả từ 1653 mẫu, Moniliella đƣợc phát hiện ở 55 mẫu (khoảng 3% chứa Moniliella), 126 chủng nấm men đen Moniliella đã đƣợc phân lập. Trên đĩa phân lập có thể chỉ có 1 khuẩn lạc Moniliella hoặc đại đa số các khuẩn lạc là Moniliella.. Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 3.
Các chủng nấm men sau khi phân lập sẽ đƣợc phân nhóm bằng hình thái tế bào, phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting.
Bảng 3.Danh sách126 chủng nấm men đen Moniliella phân lập đƣợc.
STT Tên mẫu Nơi thu mẫu KH chủng
1
Thớt, bàn thái thịt, lọ mỡ
Chợ Lớn – Xuân Hòa –
Vình Phúc TBY 1521.1, TBY 1521.2, TBY 1488.2 Văn Thai- Cẩm Giàng
– Hải Dƣơng
TBY 509.3, TBY 505.2, TBY518.3, TBY 511.3, TBY 511.2 TBY 503.3, TBY 507.2, TBY 503.2
Lƣơng Tài – Bắc Ninh TBY 635.2, TBY 636.1, TBY 621.2 TBY 629.1, TBY 628, TBY 621.1, TBY 1468, Phùng Khoang – Hà
Nội TBY 1235.1, TBY 1235.2 Hà Trung – Hạ Long –
Quảng Ninh TBY 1599.1, TBY 1605.2
Mê Linh – Hà Nội TBY 1378.5, TBY 1378.1, TBY 1418.1, TBY 1418.4, TBY 1418.6, Nghĩa Lạc – Nghĩa
Hƣng – Nam Định TBY 1152
2 Hoa
Mũi Kê Gà – Phan Thiết
TBY 1944.6, TBY 1944.9, TBY 1944.10, TBY 1944.2 TBY 1944.4, TBY 1922.4, TBY 1922.6, TBY 1944.8 TBY 1922.5, TBY 1922.11, TBY 1944.5, TBY 1923.1 TBY 1923.2, TBY 1923.3, TBY 1944.3, TBY 1897.1, TBY 1897.2, TBY 1897.4, TBY 1932, TBY 2038.1 TBY 2038.2, TBY 2038.3, TBY 2038.5, TBY 2085.1 TBY 2085.2, TBY 2085.3, TBY 2085.4, TBY 2085.5 TBY 2085.6, TBY 2038.4, TBY 2044.1,
TBY 2044.4, TBY 2044.6, TBY 2056.2, TBY 2056.1 TBY 2091.2, TBY 2118.4, TBY 2085.7, TBY 2041.2 TBY 2041.5, TBY 2118.3, TBY 2041.4, TBY 2118.1 TBY 2041.1, TBY 2041.8, TBY 2041.7, TBY 2108.7 TBY 2042.1, TBY 2041.6, TBY 2045.5, TBY 2041.3 TBY 2108.10, TBY 2092.1, TBY 2060.1, TBY 2029.4 TBY 2092.3, TBY 2054.1
Tam Đảo – Vĩnh Phúc TBY 1885
Đông Anh - Hà Nội TBY 2127.3, TBY 2127.4, TBY 2125.1 TBY 2129.4, TBY 2129.2
3 Tƣơng
Cự Đà – Thanh Oai –
Hà Nội TBY 1320.1, TBY 1320.2, TBY 1316.1, TBY 1316.2 Bần - Hƣng Yên TBY 1065.1, TBY 1065.2, TBY 1065.3
4 Nem chua Thanh Xuân - Hà Nội TBY 540.2, TBY 615, TBY 614.1, TBY 607.2, TBY 606.1 TBY 612.2
Ipomoea pes-caprae Calotropis gigantea Lantana camara L.
Hình 8.Một số mẫu hoa phân lập đƣợc Moniliella
Do điều kiện hạn chế nên các mẫu nhiều dầu mỡ nhƣ bàn thái thịt, lọ mỡ… chúng tôi mới thu thập đƣợc ở các tỉnh phía Bắc, vì vậy để đánh giá hết sự đa dạng của Moniliella phân lập tại Việt Nam trên loại mẫu này là chƣa đủ. Tuy nhiên với những mẫu có nồng độ đƣờng cao nhƣ hoa, mật ong…. chúng tôi đã cố gắng thu thập mẫu đƣợc tại nhiều địa phƣơng hơn, từ đó cũng phần nào thấy đƣợc bức tranh về sự đa dạng nấm men đen Moniliella tại Việt Nam.
Những chủng phân lập đƣợc từ mẫu nhiều dầu mỡ nhƣ nem chua, tƣơng, bàn thái thịt… bƣớc đầu phân loại sơ bộ bằng hình thái cho thấy giống với những chủng đã phân lập đƣợc trƣớc kia, đặc biệt là bổ sung những chủng trƣớc kia đã đƣợc phân loại là loài mới nhƣng số lƣợng chủng chƣa nhiều. Điều này có ý nghĩa lớn trong việc xác định độ đa dạng loài Moniliella trong mẫu nhiều dầu mỡ tại Việt Nam. Trong nghiên cứu này song song việc thu thập thêm các mẫu nhiều dầu mỡ chúng tôi đã mở rộng mẫu sang loại mẫu có nồng độ đƣờng cao nhƣ mẫu hoa, mật ong…
Thực tế cho thấy, ở những mẫu hoa mà có nhiều côn trùng nhƣ ong, kiến, bƣớm… viếng thăm thì khả năng bắt gặp Moniliella cao hơn rất nhiều so với những mẫu hoa ít đƣợc côn trùng tới, vậy thì câu hỏi đặt ra là liệu Moniliella sống trên côn trùng hay hoa ? Vì thế chúng tôi đã lấy mẫu cả hoa và côn trùng đậu trên hoa đó, kết quả là, trên hoa chúng tôi phân lập đƣợc Moniliella nhƣng côn trùng lại không. Điều này cũng có thể giải thích do Moniliella thích nghi với nơi có nồng độ đƣờng cao, ở hoa có nhiều mật do đó số lƣợng Moniliella nhiều hơn nên khi làm giàu dễ dàng phân lập đƣợc chúng hơn, còn ở côn trùng số lƣợng rất it tế bào bám vào bộ phận
trên cơ thể của chúng nên khi làm giàu và phân lập khó phát hiện đƣợc hơn. Nhƣ vậy có lẽ côn trùng có vai trò phát tán Moniliella từ hoa này sang hoa khác chứ không phải côn trùng là môi trƣờng sống của Moniliella.
Khả năng bắt gặp Moniliella trong hoa phụ thuộc vào sự viếng thăm của côn trùng còn thể hiện ở chỗ tần suất gặp Moniliella ở các mẫu hoa thu thập ở vùng núi có khí hậu ôn đới (Đà Lạt 0/43 mẫu) và các mẫu từ vùng khí hậu cận nhiệt đới phía Bắc (14/420 mẫu) thấp hơn so với các mẫu từ vùng khí hậu nhiệt đới phía Nam (20/188 mẫu), nơi mật độ côn trùng cao hơn. Tại cùng một nơi nhƣ Hà Nội, khi chúng tôi phân lập mẫu hoa vào mùa đông thì hầu hết các mẫu không phát hiện đƣợc Moniliella (0/45 mẫu), nhƣng đến mùa hè thì lại dễ dàng phân lập đƣợc
Moniliella hơn (3/ 52 mẫu), tại Tam Đảo – Vình Phúc ngay tại mùa hè, có khí hậu mát mẻ, độ ẩm cao thì số lƣợng mẫu phân lập đƣợc Moniliella cũng không đáng kể (2/110 mẫu). Trong khi các mẫu hoa tại miền Bắc thƣờng mỗi mẫu chỉ phân lập đƣợc 1 nhóm Moniliella, một số mẫu khác gồm 2 đến 3 nhóm thì ở các mẫu hoa thu thập tại miền Nam mỗi mẫu thƣờng chứa nhiều hơn 1 nhóm Moniliella. Trong một số trƣờng hợp, có đến 4 nhóm di truyền khác nhau của Moniliella xuất hiện trên cùng một mẫu hoa.
Hình 9. Vị trí các địa điểm thu thập mẫu phân lập Moniliella tại Việt Nam
3.2. Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào
Trong quá trình nghiên cứu đa dạng sinh học thì phân nhóm là một bƣớc quan trọng trong đó có phân nhóm bằng hình thái. Chúng tôi tiến hành nuôi cấy các chủng trên cùng một loại môi trƣờng, trong cùng một khoản thời gian (5 ngày) với các điều kiện nhiệt, độ ẩm...hoàn toàn tƣơng tự để tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc dùng làm cơ sở để phân nhóm sơ bộ các chủng nấm men phân lập đƣợc.
Sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng Malt-Glucose 2Bx, hình thái khuẩn lạc của các chủng khác nhau đã bắt đầu phân hóa khá rõ ràng và đa dạng. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 5. Chúng tôi tiến hành phân nhóm sơ bộ các chủng nấm men dựa trên 3 đặc điểm cơ bản của khuẩn lạc là: hình dạng, kích thƣớc, màu sắc. Sau đó làm tiêu bản quan sát hình thái tế bào dƣới kính hiển vi quang học Eclipse E600- Nikon ở vật kính 40. Hình thái tế bào và bào tử của các chủng nghiên cứu đƣợc
lƣu lại thông qua camera DFK 61AUC02 của hãng The Imaging Source (Đức) bằng phần mềm IC capture AS 2.3. Qua đó, nhận thấy nhiều chủng có khuẩn lạc khác nhau nhƣng tế bào lại không có sự khác nhau rõ ràng, ngƣợc lại nhiều chủng có khuẩn lạc giống nhau nhƣng hình thái tế bào lại có sự sai khác nhau không rõ ràng. Hình dạng và màu sắc khuẩn lạc rất đa dạng: khuẩn lạc trơn, xốp, nhăn, trên bề mặt khuẩn lạc có thể có vân, hình tia sợi, khuẩn lạc có màu trắng, vàng, đen, xám ... Kích thƣớc tế bào lớn, một số chủng tế bào có cả dạng hình que và hình elip hoặc tròn. Một số chủng không có dạng hình que. Nhiều chủng có khả năng hình thành giả khuẩn ti. Chính sự đa hình thái của khuẩn lạc và tế bào gây khó khăn trong việc phân loại chúng.
Moniliella TBY 1885 Moniliella TBY 1897.1
Moniliella TBY 2092.1 Moniliella TBY 2042.1
Hình 10.Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào một số chủng nấm men Moniliella phân lập đƣợc (thanh chèn tƣơng ứng 10 µm)
3.3. Phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting
Do sự đa dạng và sự sai khác không rõ ràng giữa các chủng về mặt hình thái khuẩn lạc cũng nhƣ tế bào làm cho việc phân loại dựa vào những đặc điểm này gặp nhiều khó khăn đó cũng chính là đặc trƣng của chi này làm cho sự phân loại chúng đến nay vẫn gây tranh cãi, phân nhóm bằng hình thái là một bƣớc để giảm bớt sự
khó khăn khi phân nhóm bằng các phƣơng pháp tiếp theo. Để đánh giá tính đa dạng của các chủng phân lập đƣợc một cách chính xác, chúng tôi tiến hành phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting 126 chủng phân lập đƣợc sử dụng mồi MST2 (có trình tự 5’-(GAC)5-3’). 126 chủng đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng Malt-Glucose 2°Bx sau 3 ngày thu nhận để tách tế bào nhƣ mô tả trong phần phƣơng pháp, sau đó tiến hành tinh chế DNA. DNA sau khi tinh chế đƣợc sử dụng để làm khuôn cho phản ứng PCR với chu kỳ gia nhiệt nhƣ đã nêu trong phần phƣơng pháp. Sản phẩm đƣợc điện di trên agarose 1 % trong TAE với hiệu điện thế 50V. Kết quả trình bày trong hình 11. Kết quả phân nhóm bằng fingerprinting đƣợc đối chiếu lại với kết quả phân nhóm bằng hình thái.
Hình 11. Phổ fingerprinting của 126 chủng Moniliella phân lập đƣợc, M – GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder (Thermo sciencetific)
Bảng 4.Ký hiệu các chủng trong PCR fingerprinting
STT Chủng hiệu Ký STT Chủng hiệu Ký STT Chủng hiệu Ký STT Chủng hiệu Ký
1 TBY 509.3 B79 33 TBY 1521.1 B111 65 TBY 2060.1 B148 97 TBY2046.1 B181 2 TBY 505.2 B80 34 TBY 1521.2 B112 66 TBY 1885 B149 98 TBY 2085.4 B182 3 TBY518.3 B81 35 TBY 1605.2 B113 67 TBY 2041.1 B150 99 TBY 1932 B183 4 TBY 511.3 B82 36 TBY 1152 B114 68 TBY 2041.8 B151 100 TBY1932 B183 5 TBY 511.2 B83 37 TBY 1378.1 B115 69 TBY2108.3 B153 101 TBY 2129.2 B184 6 TBY 503.3 B84 38 TBY 1418.1 B116 70 TBY 2054.2 B154 102 TBY 2041.4 B185 7 TBY 635.2 B85 39 TBY 1418.4 B117 71 TBY 2054.1 B155 103 TBY 2108.10 B186 8 TBY 636.1 B86 40 TBY 1599.1 B118 72 TBY 1922.5 B156 104 TBY 2108.7 B187 9 TBY 621.2 B87 41 TBY 1235.2 B119 73 TBY 1944.3 B157 105 TBY 1944.11 B188 10 TBY 540.2 B88 42 TBY 1418.6 B120 74 TBY 1944.5 B158 106 TBY 2108.8 B189 11 TBY 629.1 B89 43 TBY 1468 B122 75 TBY 2085.7 B159 107 TBY 2108.6 B190 12 TBY 615 B90 44 TBY 1897.1 B126 76 TBY 1944.7 B160 108 TBY 2042.1 B191 13 TBY 614.1 B91 45 TBY 1897.2 B127 77 TBY 1944.1 B161 109 TBY 2056.2 B192 14 TBY 607.2 B92 46 TBY 1897.4 B128 78 TBY 2041.5 B162 110 TBY 2085.8 B193 15 TBY 628 B93 47 TBY 2038.1 B129 79 TBY 2045.1 B163 111 TBY 2045.5 B194 16 TBY 606.1 B94 48 TBY 2038.2 B130 80 TBY2108.5 B164 112 TBY 2041.3 B195 17 TBY 507.2 B95 49 TBY 2038.3 B131 81 TBY2045.2 B165 113 TBY 2044.3 B196 18 TBY 503.2 B96 50 TBY 2038.5 B132 82 TBY2044.6 B166 114 TBY2044.2 B197 19 TBY 507.3 B97 51 TBY 2085.1 B133 83 TBY 2041.6 B167 115 TBY 2041.10 B198 20 TBY 621.1 B98 52 TBY 2085.2 B134 84 TBY 2045.4 B168 116 TBY 2045.6 B199 21 TBY 612.2 B99 53 TBY 2085.3 B135 85 TBY 2127.3 B169 117 TBY 2029.4 B200 22 TBY 1065.1 B100 54 TBY 2085.5 B137 86 TBY 2041.2 B170 118 TBY 2118.1 B201 23 TBY 1065.2 B101 55 TBY 2085.6 B138 87 TBY 2041.7 B171 119 TBY 2056.1 B202 24 TBY 1065.3 B102 56 TBY 1944.6 B139 88 TBY 2129.4 B172 120 TBY 2092.3 B203 25 TBY 1320.1 B103 57 TBY 1944.9 B140 89 TBY 2038.4 B173 121 TBY 2091.2 B205 26 TBY 1320.2 B104 58 TBY 1944.10 B141 90 TBY 1922.6 B174 122 TBY 2125.1 B206 27 TBY 1316.1 B105 59 TBY 1944.2 B142 91 TBY 2127.4 B175 123 TBY 1922.11 B207 28 TBY 1235.1 B106 60 TBY 1944.4 B143 92 TBY 2092.1 B176 124 TBY 1923.1 B208
STT Chủng hiệu Ký STT Chủng hiệu Ký STT Chủng hiệu Ký STT Chủng hiệu Ký
29 TBY 1316.2 B107 61 TBY 2044.1 B144 93 TBY 2118.4 B177 125 TBY 1923.2 B209 30 TBY 1448.2 B108 62 TBY 2044.4 B145 94 TBY2045.7 B178 126 TBY 1923.3 B210 31 TBY 1488.2 B109 63 TBY 2044.6 B146 95 TBY 2118.3 B179
32 TBY 1378.5 B110 64 TBY 1922.4 B147 96 TBY 1944.8 B180
Từ kết quả thể hiện ở hình 11 cho ta thấy, sản phẩm PCR nhân với mồi MST2 của các chủng nấm men có các phổ băng khác nhau và rất đa dạng do sự phân bố về số lƣợng bản sao cũng nhƣ vị trí của DNA vệ tinh trong genome. Kỹ thuật phân nhóm sử dụng mồi thiết kế dựa trên DNA vệ tinh cho độ phân giải đến dƣới loài. Các chủng có cùng một phổ băng chắc chắn sẽ thuộc cùng một loài, các chủng có