Các chủng đƣợc so sánh bằng phản ứng PCR khuếch đại các đoạn vi vệ tinh sử dụng mồi MST2 có trình tự (GAC)5. Phổ PCR fingerprinting chỉ ra rằng những chủng thuộc 3 loài M. carnis, M. dehoogii và M. byzoovii khác biệt về mặt di truyền. Tính đồng nhất giữa các chủng trong cùng 1 loài cao và chỉ sai khác chút ít về độ đậm nhạt của các băng điện di quan sát (Hình 13, 14).
Hình 13. Phổ PCR fingerprinting với mồi (GAC)5 của các chủng Moniliellacarnis và
Moniliella dehoogii. M – GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder (Thermo sciencetific); từ 1 đến 5
– các chủng M. carnis (1- KFP 246; 2- KFP 405; 3 - KFP 452; 4 - TBY 202.2; 5 - TBY
385.2);từ 6 đến 13 – những chủng M. dehoogii (6 - KFP 211; 7 - KFP 149; 8 - TBY 198.2;
9 - TBY 210.2; 10 - TBY 209.4; 11 - TBY 197.4; 12 - TBY 384.1; 13 - TBY 348) tƣơng ứng.
Hình 14. Phổ PCR fingerprinting với mồi (GAC)5 của các chủng Moniliella byzovii. M-DNA GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder (Thermo sciencetific); từ 1 đến 12, các chủng
TBY 2041.8, TBY 2108.5, TBY 2041.7T, TBY 2046.1, TBY 1932, TBY 2108.10, TBY
2108.7, TBY 1944.11, TBY 2042.1, TBY 2085.8, TBY 2045.5 và TBY 2044.2, tƣơng ứng.
Mƣời hai chủng M. byzoovii về mặt hình thái khuẩn lạc có sự khác nhau, chúng chia làm 2 nhóm màu sắc rõ rệt là nhóm màu xanh lục đến đen và nhóm màu
trắng, về hình thái tế bào lại giống nhau. Các chủng cũng đƣợc so sánh bằng phản ứng PCR khuếch đại các đoạn vi vệ tinh sử dụng mồi MST2 có trình tự (GAC)5. Kết quả cho thấy các chủng màu xanh lục, đen và các chủng màu trắng (bảng 7) đều cho phổ finger giống hệt nhau, nhƣ vậy chúng đều cùng 1 loài, màu sắc khuẩn lạc là do đặc tính từng chủng.
Bảng 7.Danh sách các chủng thuộc 2 nhóm M. byzovii
Ký hiệu
chủng Màu sắc khuẩn lạc Nguồn phân lập
TBY 2041.7T Xanh lục, đen Hoa bìm bìm biển héo (Ipomoea pes-caprae
TBY 2041.8 Trắng Hoa bìm bìm biển héo (Ipomoea pes-caprae
TBY 1932 Xanh lục, đen Hoa bìm bìm biển tƣơi (Ipomoea pes-caprae)
TBY 1944.11 Trắng Hoa mủ (Calotropis gigantea)
TBY 2042.1 Xanh lục, đen Hoa bìm bìm biển héo (Ipomoea pes-caprae)
TBY 2044.2 Trắng Hoa bìm bìm biển héo (Ipomoea pes-caprae)
TBY 2045.5 Trắng Hoa bìm bìm biển héo (Ipomoea pes-caprae)
TBY 2046.1 Trắng Hoa bìm bìm biển héo (Ipomoea pes-caprae)
TBY 2108.5 Trắng Hoa bìm bìm biển héo (Ipomoea pes-caprae)
TBY 2108.7 Xanh lục, đen Hoa bìm bìm biển héo (Ipomoea pes-caprae) TBY 2108.10 Xanh lục, đen Hoa bìm bìm biển héo (Ipomoea pes-caprae)
TBY 2085.8 Trắng Hoa bìm bìm biển héo (Ipomoea pes-caprae)
Đối với phân tích cây phát sinh chủng loại, trình tự đoạn D1/D2 của gen LSU rRNA đƣợc phân tích với 3 chủng đại diện từ mỗi loài. Đoạn trình tự này đƣợc nhân lên theo phƣơng pháp PCR và giải trình tự nhƣ đã đƣợc mô tả. Khi phân tích cây phát sinh chủng loại, kết quả đọc trình tự đƣợc so sánh với những trình tự đã biết trong GenBank sử dụng cơ sở dữ liệu mạng tìm kiếm cơ sở nucleotit-nucleotit Blast trong NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (Altschul và cộng sự, 1997). Những trình tự tƣơng đồng nhất đƣợc chọn lọc sử dụng chƣơng trình TextPad 4.2 (Helios Software Solution) và sử dụng Muscle (Edgar, 2004) bao gồm trong chƣơng trình MEGA 5.3 (Tamura et al., 2011) để so sánh sắp xếp. Cây phát sinh chủng loại
đƣợc xây dựng dựa trên sự biến đổi về khoảng cách sai khác trình tự theo Kimura (1980), sử dụng phƣơng pháp neighbour-joining (Saitou & Nei, 1987) trong MEGA. Chƣơng trình phân tích đƣợc thực hiện từ 1000 dữ liệu lấy ngẫu nhiên (Felsenstein, 1985). Trình tự AF411823 của Phylloporia pectinata R. Coveny 113 đƣợc sử dụng nhƣ trình tự ngoài nhóm.
Phân tích trình tự đoạn gen D1/D2 LSU rRNA cho thấy M. carnis KFP 246T đồng nhất với chủng KFP 452, trong khi đó KFP 405 có 1 nucleotit khác biệt (mất 1 nucleoit). Loài đƣợc biết gần nhất là M.suaveolens. M. carnis KFP 246T có trình tự sai khác tới 37 nucleotit (tƣơng đƣơng 6.5%) so với trình tự chuẩn M. suaveolens
CBS 542.78T. Đối với M. dehoogi, chủng TBY 198.2 và TBY 348 sai khác với KFP 211T hai nucleotit (thay thế 1 nucleotit, mất 1 nucleotit). Loài gần nhất đƣợc biết của M. dehoogi là M. spathulata có sai khác 65 nucleotit (tƣơng đƣơng 12%) so với trình tự chuẩn CBS 241.79T
. M. carnis và M. dehoogii có khoảng cách xa nhau, chúng khác nhau 83 nucleoit (14%) trong đoạn D1/D2 LSU rRNA. M.dehoogii and
M. carnis, cùng với M. suaveolens và M. spathulata, hình thành một nhánh phát sinh từ một gốc (hình 5).
M. byzovii TBY 2041.7T có trình tự sai khác với chủng chuẩn CBS 10551T của loài M. fonsecae là loài gần nhất tới 52 nucleotit (tƣơng đƣơng 10.3 %) trên đoạn D1/D2 và 71 nucleotit trên vùng ITS (tƣơng ứng 16.9 %). Trong cây phân loại, M.
byzovii và M. fonsecae hình thành từ cùng 1 nhánh (Hình 12).